导　　师： 林浩然

学科专业： G0703

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 中山大学

摘　　要： 中国大鲵是我国特有的珍稀物种，为水生鱼类演化到陆生爬行类的过渡类型。由于人为过度捕杀，生境破坏，以及自身繁殖率低等因素，造成其自然种群数量锐减，并处于极度濒危状态，已被我国列为国家二级保护动物。为恢复中国大鲵资源，目前已广泛开展人工养殖，但由于亲本过少，养殖模式不合理，容易引起近交衰退。本研究通过cdna文库构建和筛选、随机扩增多态dna（rapd），扩增片段长度多态（aflp）、线粒体dna（mtdna）序列分析等技术，从种质资源保存和评价两个层面进行中国大鲵种质资源保护研究。通过保存中国大鲵种群遗传信息，评价自然种群及养殖群体的种质状况，为中国大鲵资源的保护和可持续利用提供科学依据。主要研究结果如下： 1.中国大鲵脑组织cdna文库构建。 本文以中国大鲵脑组织为材料，提取总rna，应用cloneminertm文库构建技术构建了cdna文库。经检测，文库初始滴度为5×105 cfu/ml，重组率为91.70％，插入片断大小在0.35～3.9 kb，平均插入片段大小为0.791 kb，文库扩增后滴度为4.0×109 cfu/ml。随机挑选200个阳性克隆测序，经生物信息学分析，发现20个片段与已报道的基因有较高同源性，包括促甲状腺激素基因、生长激素（growth hormone，gh）基因及催乳素（prolactin，prl）基因等。 2.gh和prl组织分布及系统发育应用分析。 采用半定量rt—pcr方法分析了gh和prl基因在成体中国大鲵各组织中的mrna表达情况，结果表明：gh，prl只在垂体中检测到表达；这与其他鱼类和哺乳类的研究结果相一致。基于gh和prl cdna序列与氨基酸序列构建的两栖类系统发育树能够反映中度远源的两栖类真实发育关系。该基因家族的两个基因可以得到较为一致的树型，具有相近的系统发育分析能力。对功能基因数据源的进一步比较发现，核苷酸编码区前两个密码子序列与氨基酸序列在解决较远的系统发育关系时均具有相似价值，但是在mp法分析时，核苷酸序列略微优于氨基酸序列。gh在解决有尾目分类时，nj树与mp树结果与传统的有尾目分类关系一致。 3.采用aflp标记及线粒体控制区序列分析方法对中国大鲵野生种群的遗传多样性和遗传结构进行分析。 aflp标记被用于检测5个自然种群的遗传多样性。采用9对引物组合对60个个体共扩增出501条带，其中多态性条带354（69.82％）；中国大鲵高水平的遗传多样性符合其生活史特征及地理分布，显示作为一种古老物种的强大的潜在适应力。amova分析表明中国大鲵遗传多样性绝大部分位于种群内（97.94％）。种群间遗传分化较弱（fst类似物θ=0.1368；φst=0.021，p<0.001）。种群间遗传距离（φst）和地理距离不相关（所有群体：r=0.1887，p=0.3150；长江流域群体：r=0.5336，p=0.3320）。聚类结果基本依照长江流域、黄河流域分为两支。基于个体距离的聚类结果显示，多数黄河流域个体与长江流域个体聚为一支，存在一定的混乱。对8个种群15个个体线粒体控制区序列进行分析，在789 bp长的片段中共得到25个变异位点，定义10个单倍型。单倍型多态性和核苷酸多态性分别为0.895和0.960％，显示控制区可以揭示中国大鲵丰富的遗传多样性水平。各单倍型间kimura-2-parameter距离在0.001～0.022之间，平均为0.014，显示分化较小。聚类结果大致可以分为黄河流域种群、长江流域种群及珠江流域种群，体现了与地理分布格局的统一性。但仍有个别个体聚类混乱。可能由于长期存在人为因素的干扰所致。结合遗传结构结果及化石证据，推测中国大鲵种群的扩散途径为由北至南。此外还将中国大鲵与近缘物种以及进化历程相近的物种的遗传多样性进行比较，以期进一步阐明中国大鲵遗传背景，为保护和利用这一珍稀古老物种的种质资源提供理论依据。针对目前中国大鲵遗传背景及保护现状，对中国大鲵野生种群资源的保护提出建议。 4.利用随机引物扩增多态dna（rapd）及扩增片段长度多态性（aflp）标记对中国大鲵人工养殖四个世代群体进行了遗传多样性检测。 本研究rapd分析使用了20条随机引物，共扩增出91个位点，多态位点比例为亲代46.15％、子一代42.86％、子二代39.56％，子三代16.48％。中国大鲵世代群体的香农信息指数（0.2787±0.0330、0.2556±0.0319、0.2301±0.0309、0.0644±0.0164）和基因多样性指数（0.1935±0.0234、0.1759±0.0223、0.1573±0.0215、0.0401±0.0107）均呈逐代下降之势，进一步anova分析显示中国大鲵在繁育至子二代时差异并不显著，到子三代时达到极显著水平。aflp方法使用九对引物组合，在中国大鲵四个世代群体60个样品中共得到490个位点，其中多态位点数为291个，多态比例为59.39％。而中国大鲵亲代、子一代、子二代和子三代群体多态位点比例分别为48.16％、44.69％、44.08％和32.24％，呈递减趋势。香农信息指数（0.2775±0.0134、0.2539±0.0132、0.2481±0.0132、0.1827±0.0124）和基因多样性指数（0.1884±0.0092、0.1722±0.0091、0.1681±0.0091、0.1240±0.0085）也呈相同趋势，anova分析结果表明中国大鲵世代间遗传多样性的下降程度在繁育至子二代时并不显著，到子三代达到显著水平。本文结合中国大鲵的养殖特点，分析了人工养殖对中国大鲵遗传多样性的影响，并提出相应的保护措施。

关 键 词： 中国大鲵 种质资源 遗传多样性 生长激素

分 类 号： [S947.3]

领　　域： [农业科学] [农业科学]