导　　师： 周世宁

学科专业： G0703

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 中山大学

摘　　要： 深海环境通常具有高盐，高压，高/低温，无光照等特点使得海洋微生物存在一套独特的生理代谢机制和分子细胞结构，因此研究和开发新的海洋生物催化剂和活性物质具有重要意义。迄今绝大部分深海微生物不能在实验室条件下被分离培养，深海微生物资源开发遇到很大挑战。本研究通过不依赖培养的方法研究海洋微生物的基因资源，首次构建了中国南海深海沉积物fosmid宏基因组文库，共获得约39,600个克隆，插入片段范围在24～45kb之间，平均插入片段大小为33kb。克隆片段的总库容达到1，320mb，以每种细菌的基因组大小4mb为计，则整个文库最大可以包含深海沉积物中330种细菌的基因组dna。大容量文库的构建为有效的筛选功能基因打下了基础。 在文库筛选过程中发现一株在lb平板能产生棕黑色物质的克隆子fss6，通过紫外-可见光吸收光谱，红外吸收光谱，电子顺磁共振光谱等物化分析手段，鉴定fss6产生的棕黑色素即为黑色素。基于鸟枪法构建fss6质粒dna随机片段文库，获得了一株同样能够产生黑色素的亚克隆fss61。分析fss61外源片段序列，并通过亚克隆表达证实，黑色素的产生与其中orf2(命名为hppd)单个基因的表达产物有关。hppd基因编码产物为354个氨基酸，分子量约为40kda。blastp相似性搜索结果表明orf2编码的蛋白质序列与各种细菌来源的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(hppd)有着最高的相似性。利用高效液相色谱(hplc)，对克隆子me12(包含orf2)发酵产物进行分析，在其还未产生黑色素的发酵液上清中检测到大量尿黑酸(hga)的存在，说明了orf2表达产物即为4-羟苯基丙酮酸双加氧酶，尿黑酸是其催化产生并且成为黑色素前体。由此我们推测克隆子fss6和fss61产生黑色素的途径是：培养基中的酪氨酸被大肠杆菌的转氨酶催化产生羟苯基丙酮酸(hpp)，后�

关 键 词： 深海环境 海洋微生物 深海沉积物 基因组文库 功能基因 基因组 高效液相色谱 克隆子

领　　域： [天文地球] [生物学]