导　　师： 徐杰

学科专业： G1001

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南师范大学

摘　　要： 乙醇酸氧化酶(ecl．1.3.15，go)是植物光呼吸的关键酶。蛋白和基因水平均证实，go只含一种40kd亚基，但go却具有多个等电点。从绿叶中提取go，在向正极泳动的sds-page中只出现40kd，其phe含量极低，以至不能被测定出来；而在sds-醋酸纤维素薄膜电泳中却出现向正极和负极泳动的两种蛋白。向正极泳动的是go40kd亚基；而向负极泳动的则是碱性的富含phe的蛋白(ppgo，phe-rich protein)，ppgo的phe在60％-65％。我们实验室初步证实，ppgo包裹go形成ppgo-go复合蛋白，导致ppgo-go复合蛋白在258nm有吸收峰，以及ppgo-go复合蛋白抗体只识别ppgo而不识别g040kd亚基，go40kd亚基只被其自身抗体所识别。因此，ppgo-go复合蛋白抗体只与ppgo有关，与go无关。ppgo-go复合蛋白抗体识别绿叶粗蛋54kd/14kd等带。由于1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ec 4.1.1.39，rubisco)的rbcs/rbcs(rbcl/rbcs)的分子量也是54kd/14kd，且占绿叶总蛋白的50％-60％，故识别54kd/14kd可能与rbcl/rbcs有关。 由于ppgo-go复合蛋白抗体与go无关，且go无论在结构和细胞定位上，均与rubisco完全不同，以上54kd/14kd等带的免疫交叉反应与go无关。另外，ppgo和rubisco的氨基酸组成完全不同，ppgo和rubisco两者也不太可能产生免疫交叉反应。除非rubisco也被同一ppgo所包裹，ppgo和rubisco也组成ppgo-rubisco复合蛋白，并且在sds-变性处理后，而rubisco解离为rbcl/rbcs，但rbcl/rbcs仍和ppgo结合在一起，分别形成ppgo-rbcl和ppgo-rbcs，ppgo-go复合蛋白抗体才能通过ppgo而间接识别54kd/14kd的rbcl和rbcs。 为证实以上推测，本文以氨基酸组成测定和免疫杂交为主要手段，对ppgo-go复合蛋白和rubisco的关系、rubisco是否被同一ppgo所包裹，以及rbcl/rbcs是否仍和ppgo结合在一起等进行研究： 从菠菜绿叶中提取的rubisco，具有rubisco活性，在native-page中呈一条约560kd条带，在sds-page中呈现54kd/14kd两条带，表明该rubisco的电泳特性与报告的一致。 提取的rubisco经sds-醋酸纤维素薄膜电泳，出现向正极和负极泳动的两种蛋白。sds-page后，从负极缓冲液中获得向负极泳动的蛋白pprbc，其phe含量在64％。因此，提取的rubisco中还含有pprbc，我们称之为pprbc-rubisco，无论氨基酸组成和向负极泳动，ppgo和pprbc都很相似，同时，免疫反应表明，ppgo抗体也识别pprbc，表明ppgo和pprbc是同一蛋白。如果pprbc也包裹rubisco，pprbc-rubisco经sds-page，rubisco解离为rbcl/rbcs，但仍和pprbc结合在一起，出现pprbc-rbcl和pprbc-rbcs那么，ppgo-go复合蛋白抗体可以通过pprbc识别rbcl/rbcs。 事实也表明，pprbc-rubisco经sds-page，从正极的凝胶中分别获得的54kd/14kd蛋白，其phe含量为7.65％/24.24％，而菠菜rbcl/rbcs的cdna编码的rbcl/rbcs的phe含量分别为4.59％和6.61％。54kd/14kd蛋白的phe含量明显高于rbcl/rbcs，表明54kd/14kd蛋白除含有rbcl/rbcs外，还含有一个富含phe的蛋白。有必要用免疫方法研究该蛋白与ppgo和pprbc的关系。进一步用免疫方法证实，在非sds变性的dot b1ot中，ppgo-go复合蛋白抗体、ppgo抗体、pprbc-rubisco抗体、54kd蛋白抗体，以及14kd蛋白抗体均识别pprbc-rubisco和ppgo-go复合蛋白。在sds-page western-blot中，以上五种抗体均同样识别54kd蛋白/14kd蛋白。因此，pprbc和rubisco紧密结合，形成pprbc-rubisco复合蛋白。在sds处理后，54kd蛋白实际上是pprbcl-rbcl；14kd蛋白是pprbcs-rbcs。 两批提取的pprbc-rubisco复合蛋白经sds-page后经考马斯亮蓝染色，均呈现54kd/14kd两条带，但pprbc-rbcl抗体(即p54kd蛋白抗体)只识别其中一条54kd。而另一条54kd可能是rbcl，即pprbc可能已经从rbcl中完全解离下来，此时的54kd已经不含pprbc，导致不被pprbc-rbcl抗体所识别。因此，54kd有时含pprbc；而有时不含pprbc，导致前人报的rbcl/rbcs的抗体有时存在；而有时不存在免疫交叉反应。

关 键 词： 二磷酸核酮糖羧化酶 加氧酶 乙醇酸氧化酶

分 类 号： [Q946.1]

领　　域： [生物学]