导　　师： 张细权

学科专业： I0501

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 乌龟(chinemys reevesii)是我国广泛分布的水产养殖经济动物，具有较高的食用和药用价值，素有长寿动物之称。利用透射电镜技术对脑垂体超微结构进行了观察，采用rt-pcr、race和pcr技术对生长激素基因全长序列进行克隆和测序，以及实时荧光定量pcr检测技术进行基因组织表达的研究，揭示乌龟在生长、繁殖调控组件上的结构特征，为探索长寿调控机制提供有用的生物学依据，并有利于开展乌龟生物资源利用和保护。 实验结果表明：乌龟脑垂体由神经垂体和腺垂体组成的背腹结构类型。神经垂体分为漏斗部和神经部；腺垂体分为远侧部和中间部。远侧部包含有gh细胞、gth细胞、prl细胞、tsh细胞和acth细胞等5种激素分泌细胞，以及非分泌类型即滤泡-星形细胞(嫌色细胞)。gh细胞呈圆形、胞径8～10 μm，细胞核球状，核质比例大，核仁明显1个。胞质中分泌颗粒少，圆形，直径250～300 nm，大小基本一致，有线粒体、粗面内质网、高尔基体等。冬季gh细胞分泌颗粒极少，个别gh细胞未见分泌颗粒，乌龟生长缓慢可能与gh细胞分泌颗粒少有关。gth细胞只有一种类型，胞体近圆形或卵圆形，胞径10～12μm，胞质内有大量分泌颗粒，呈圆形。分泌颗粒分为大小两种类型，粗面内质网分散分布，有1-2个大空泡。冬季的gth细胞中，分泌颗粒释放后留下大量空泡。冬季垂体中gth细胞、gh细胞和tsh细胞可能存在分泌颗粒退化性生理变化，由细胞核出现裂陷或内凹，以类似“吞食"形式对过剩的分泌颗粒进行“回收"分解，避免激素释放带来副作用。这种现象在脊椎动物的脑垂体中从未见报道。 首次在爬行动物中进行gh基因的克隆和测序，先由长度12 bp的设计引物扩增得到特异性带，再通过race方法获得乌龟ghcdna全长791 bp序列，包括66 bp的5'utr，654bp的orf，71 bp的3'utr。编码217个氨基酸，由26个氨基酸的信号肽和191个氨基酸的成熟肽组成，推测gh蛋白质分子质量约为24856.68 da，等电点为7.78。ghcdna序列登录号为ef424785，氨基酸登录号为abo09819.1。gh 基因由5个外显子和4个内含子构成，外显子长度分别为76、164、117、162、272 bp，内含子长度分别为2486、1219、890、3131 bp。序列全长为8517 bp，内含子总长度7726 bp，是目前所有报道脊椎动物具最长内含子的gh基因，可能对gh转录和表达的时效性产生影响，并与乌龟的生长缓慢和长寿调控机制有关。gh基因全序列登录号为eu647240。乌龟gh基因编码序列中gc和at含量分别为50.46％和49.54％，乌龟gc和at比例介于哺乳类、鸟类(gc>at)和两栖类、鱼类(at>gc)两者之间，符合生物进化规律。乌龟ghcdna．与鸟类的同源性最高，如与鸵鸟、鸭、鸡、鹅、火鸡分别是85.0％、83.4％、83.4％、83.3％、82.5％。演绎成氨基酸序列与同属于爬行动物的鳄鱼和绿海龟的同源性达到99.0％和92.6％，gh基因cdna核苷酸序列的同源性与氨基酸序列的同源性基本一致。 对乌龟体内16种组织gh基因表达进行分析表明，只有脑垂体检测到gh基因表达，而在大脑、小脑、下丘脑、脂肪、卵巢、肌肉、胃、心脏、肝脏、肾脏、输卵管、脾脏、小肠、肺和胰脏15种组织部位没有表达。 在自然环境中，乌龟受到食物来源的制约，gh细胞激素分泌颗粒较少，降低对igf-i分泌的诱导，造成生长缓慢，有利于抵抗衰老和保持长寿。gh基因内含子显著较长，可能对gh的表达产生滞后影响，同时未发现垂体外表达。因此，乌龟适合作为寿命调控机制研究的动物模型。

关 键 词： 乌龟 脑垂体 超微结构 生长激素基因 基因克隆 基因测序 分子特征

分 类 号： [S917 S961.6]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学]