导　　师： 马庆生;武波

学科专业： G1005

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 广西大学

摘　　要： 硫是所有生命体的重要组成元素之一，自然条件下主要以氧化态硫酸盐形式存在；植物、微生物吸收、还原硫酸盐将之同化为自身物质；生物体内的硫主要以还原态存在。 根瘤菌结瘤因子还原性末端的硫化修饰与其宿主特异性密切相关。费氏中华根瘤菌是一类最先在中国分离的快生型根瘤菌，可使大豆及多种豆科植物结瘤、固氮。为构建广宿主高效固氮工程菌奠定基础，本文着重研究费氏中华根瘤菌hn01硫代谢相关基因的一些生物学功能。 本实验室前期工作以tn5gusa5随机插入诱变hn01获得一株硫代谢缺陷突变体gxhn100，此突变体的互补质粒为pgxhn300，内含8 kb外源片段。亚克隆和信息学分析显示该片段含五个转录方向一致的开放阅读框架(open reading frame，orf)：orfa、orfb、orfc、orfd、orfe；orfa和orfe的上游区域分别是启动子pa和pe。以载体pk18mob定向突变orfa、orfb、orfc、orfd获得相应非极性突变体hma4、hmb2、hmc6和hmd3，发现orfa、orfc、orfd与硫代谢相关，分别将它们命名为cysg、cysⅠ和cysⅡ。本文在此基础上研究orfa、orfb、orfc、orfd、orfe在hn01体内的转录关系及cysg、cysⅠ和cysⅡ怎样参与硫/氮代谢和它们在结瘤、固氮中的作用。 以出发菌株及各基因突变体的总rna为模板，反转录pcr并分析pcr产物表明：cysg、orfb、cysⅠ、cysⅡ和orfe均有转录产物，说明它们是功能性基因；前4个基因组成—多顺反子，证明它们构成一操纵子，命名为hsmroα(hn01 sulfur metabolism relative operon)，而orfe不与前4个基因组成—转录单元。 检测hma4、hmc6和hmd3的亚硫酸还原酶活性发现它们仅分别为出发菌株的1.68％、2.3％和1.1％，表明cysg、cysⅠ和cysⅡ经亚硫酸还原酶活性与硫代谢关联。 甲硫氨酸/氯化铵为硫/氮源条件下，hma4、hmc6、hmd3的生长趋势与hn01的无显著差别，说明cysg、cysⅠ和cysⅡ与氨态氮代谢无关。硫源不变，亚硝酸盐为氮源时，突变体hmc6和hmd3的生长趋势与hn01无显著差别，它们的亚硝酸还原酶活性与出发菌株的相当，证明cysⅠ和cysⅡ基因不参与硝态氮的代谢过程。hma4在甲硫氨酸/氯化铵为硫/氮源的生长条件下，比出发菌株延迟8-9小时到生长稳定期，其亚硝酸还原酶活性在诱导1小时后仅为出发菌株的53.5％，说明cysg和硝态氮代谢相关。 在植株营养液的最初硫源为硫酸盐时，接种大豆的植株实验发现hma4、hmc6和hmd3的结瘤时间分别比出发菌株延迟1天、2天和1天，其竞争结瘤能力分别下降了27.8％、22.2％和25.4％。当植株营养液的最初硫源为甲硫氨酸时，hma4、hmc6和hmd3的缺失功能得到恢复，说明无机硫代谢缺陷影响hn01的结瘤效率和竞争结瘤能力。另外，在相同培养条件下hma4、hmc6和hmd3的固氮酶活性与出发菌株无显著差别，证明cysg、cysⅠ和cysⅡ与固氮效率没有必然联系。

关 键 词： 根瘤菌 结瘤因子 硫代谢 操纵子 基因突变 固氮酶

分 类 号： [Q939.114]

领　　域： [生物学]