导　　师： 于晓军

学科专业： J0105

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 汕头大学

摘　　要： 背景
死亡时间(POSTMORTEM INTERVAL,PMI)推断一直是法医学研究和实践中的重点和难点课题，如何快速、准确、方便的推断PMI，对于死亡案件犯罪嫌疑人的排查、侦破，以及医疗纠纷和财产继承等司法审判，均具有重要意义。目前国内外学者已应用各种方法，力图实现准确、可靠和实用地推断PMI，但是，这些研究大多局限于单一尸体变化现象或单一物质的死后时序性变化的检测，尚未获得公认的可实际应用突破性进展。
机体死后各器官组织细胞的新陈代谢停止，失去整体调控和局部代谢平衡的活体内外理化环境，细胞溶酶体的水解酶、胃肠道及消化腺的消化酶和消化液，以及体内腐败菌和体外昆虫等相互作用，形成了复杂的尸体内外理化环境，综合导致尸体组织发生自溶、腐败、风化的宏观时序性变化过程。其本质为组织细胞中结合的和游离的生物大分子持续性降解，及其混杂腐败微生物和嗜尸性昆虫的消化性代谢的生物化学反应过程，即蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等生物大分子-有机中分子-有机小分子-无机中分子-无机小分子-离子和元素的单向性降解或水解过程。这种生物尸体“回归自然”的降解代谢过程，存在着与活体生长代谢生化基本原理相应的“逆向反应”规律性。因此，基于高通量和超微量的生物组织代谢物定性定量检测和组群指标数据分析的代谢组学理论及技术，完全适用于研究尸体组织化学变化规律，及其时序性降解代谢路径中与PMI相关的物质组合图谱和标志物，既相对独立又相互重叠的最佳“窗口期”，用于从个体死亡开始至白骨化的尸体变化全程不间断精确推断PMI。
本研究是在 “利用组织生物力学性状时序性变化推断死亡时间”的前期实验中，发现尸体组织经过标准化定时、定位、定形、定量的取材之后，常规福尔马林溶液定比和定时固定的“六定”萃取液，肉眼观固定液的颜色和浑浊度呈时序性加深的规律，提示死后不同时间尸体组织自溶腐败的时序性产物，可被福尔马林溶液萃取，进而通过各种先进的物质理化定性定量仪器，进行与PMI相关代谢物的指纹图谱和代谢轮廓分析。因此，拟采用紫外-可见分光光度法(ULTRAVIOLET AND VISIBLE SPECTROPHOTOMETRY,UV-VIS)分析家猪及人尸体肝组织不同PMI“六定”固定-萃取液的色度、成分及其含量的变化，探讨肝组织自溶腐败过程的时序性量变和质变规律，筛选推断PMI最佳指标。
目的
1、建立恒温恒湿条件下家猪肝组织死后变化模型，标准化“六定”取材和常规福尔马林固定-萃取液，UV-VIS检测液体的色度、成分及其含量变化与PMI的相关性。
2、随时获得已知死亡时间的人尸体肝组织检材，标准化“六定”取材不同 PMI 的检材，及其和固定-萃取液，结合死因和环境温度因素，初步探讨尸体组织代谢组学的理论和技术应用于实际人尸体，推断PMI的可行性。
方法
1、屠宰场健康成年家猪肝脏7例，放置温度25℃-湿度70(±5)%恒温箱保存，按照标准化“六定”取材方案：①定时，按0H、6H、12H、18H、24H、30H、36H、48H、60H、72H、84H、96H、108H、120H、132H、144H、156H 时间点取材 7 例/组；②定位，肝右叶裸区中部，避开被膜、肝门及较大血管和胆管；③定量，每样本切取5G；④定型，肝组织成型阶段，切取近立方体状，以使其表面积基本均等；⑤定比，前“四定”取材样本，均按1:10质量-溶液比固定于10%蒸馏水-甲醛液(1:10配制)，即10%福尔马林固定液50ML；⑥定期，同时以固定液兼萃取液放置 72H 后，单层滤纸过滤固定-萃取液 40ML，即“六定”取材备用。
2、深圳市公安局技术处法医检验中心2011年3月-7月明确PMI不同死因男性尸体23例， 18~40周岁，均-5℃±3℃冰柜冰冻数小时~数月，室温解冻后，常规尸检取肝，室温保湿放置，按0H、6H、12H、18H、24H、30H、36H、48H、60H、72H、84H、96H、108H、120H、132H、144H、156H、168H、180H、192H时间点，同上标准化“六定”取材备用，
3、取材前观察记录每个时间点肝组织大体形态学变化，拍照后选择颜色分布均匀的3个区域，每个区域选取5个点，计算机取色软件检测RGB颜色色值。萃取液直接紫外-可见光分光光度仪色度检测和PH仪测定酸碱度；提取5ML萃取液，5000R/M离心5MIN，取上清液，蒸馏水32倍稀释后，紫外-可见光分光光度仪定性定量扫描分析。
结果
1、肉眼观家猪肝组织大体颜色的时序性变化，0-18H暗红色、24-30H火砖色、36-72H褐玫瑰红色、84-108H亮灰色、120-156H灰色。计算机取色软件测定的各时间点肝组织大体照片RGB颜色色值，随PMI呈0-84H时序性上升，84-120H时序性下降，与PMI相关性YR=-0.168X2+25.27X+23.46(R2=0.940),YG=-1.294X2+29.25X+-9.597(R2=0.927),YB=-1.095 X2+26.82X+-8.685(R2=0.923) ；132-156H呈“平台期”。
2、紫外-可见光分光光度计，结合铬钴比色法，可见光区测得家猪肝组织”六定”固定-萃取液色度(ABS350NM)随着 PMI 延长的时序性上升趋势，与 PMI 呈近似直线正相关， Y=42.643X-17.525/R2=0.987（P<0.05），精确度达12H。
3、紫外-可见光分光光度计，1100-190NM 范围全波长扫面，家猪和人肝组织的固定-萃取液均在紫外光区 268(±10)NM 波段，出现稳定的吸收峰，峰位、峰形及其他波段杂峰均基本相同。ABS268(±10)NM值随PMI延长呈时序性上升趋势。在0H-120H期间，家猪肝组织ABS268(±10)NM随 PMI 呈近似线性正相关，Y=0.062X+0.079/R2=0.961（P<0.05），精确度达12H；120H后变化趋势不明显呈“平台期”表现；人肝组织ABS268(±10)NM值随PMI延长，逐渐升高的趋势，死后30H内，与PMI呈近似直线正相关，Y=0.012X+0.119/R2=0.812。
4、家猪肝组织固定-萃取液均呈酸性，其中，0H-120H时间段，PH值随PMI延长呈下降趋势，与PMI呈近似线性负相关，Y=-0.087X+4.454/R2=0.931(P<0.05)，精确度达12H,；120H以后PH值变化趋势不明显，呈“平台期”表现。
5、不同死因情况下，人尸体肝组织固定-萃取液 ABS268(±10)NM值存在一定差异性。相同温度(25℃)下，失血性休克死与捂压口鼻机械性窒息死比较，肝组织各时间点ABS268(±10)NM值，失血性休克死均高于窒息死，差异显著P<0.05，二者PMI相差55-56.5H；而相同死因的，各时间点ABS268(±10)NM值差异无显著性P>0.05。
不同环境温度情况下，4 月份 25℃和 7 月份 30℃的失血性休克死者，相同时间点ABS268(±10)NM值7月组高于4月组，差异显著P<0.05，二者PMI上相差1-16H。4月和6-7月份窒息死者，相同时间点ABS268(±10)NMS值6-7月组高于4月组，差异显著P<0.05，二者PMI上相差35-58H。
结论
1、借助计算机软件系统读取肝组织大体照片的 RGB 颜色色值，可提高分辨率，替代传统的色泽主观定性表述，较精细量化地测定色值，获得与PMI相关的客观量化数理公式，用于规范标准化地推断PMI。
2、尸体组织自溶腐败风化的死后降解代谢及其产物的时序性变化与 PMI 之间存在明显的正相关性，适用代谢组学理论和技术，获得相关推断PMI理化公式；不同死因和环境温度可明显地影响尸体组织自溶腐败的时序性降解生物化学过程。
3、规范化“六定”取材，特别是常规福尔马林液可作为尸体组织标本的固定兼萃取液，直接或进一步分离提取液，可进行尸体组织代谢组学检测；在死后120H内，肝组织固定-萃取液的色度和ABS268(±10)NM值，均随PMI延长呈明显时序性上升趋势，PH值随PMI延长呈明显时序性下降趋势，可作为推断PMI 的科学准确、简单量化新方法，亦可与其他尸体组织代谢组学的指标，相互结合地更准确滴推断PMI；
4、人和猪肝组织的固定-萃取液的ABS268(±10)NM值出现的物质吸收峰位和峰型，以及杂峰均基本相同，提示两者组织蛋白质和核酸等生物大分子及其死后降解代谢的生物化学过程相似，即家猪适合替代人体进行尸体化学方面的研究。

关 键 词： 死亡时间 尸体组织 代谢组学 色度量化 尸体化学

分 类 号： [S81 TP3]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [自动化与计算机技术]