导　　师： 黄寿山;任顺祥

学科专业： I0402

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 本文通过流式细胞术、形态学观察、激光共聚焦显微镜等方法研究了绿僵菌素A、B对斜纹夜蛾SL-1细胞形态学特征、生理环境、信号转导通路、细胞周期等方面的影响，对绿僵菌素A、B诱导SL-1细胞类凋亡的形态特征变化和对信号转导的影响进行了初步阐明，具体结论如下： ⑴绿僵菌素A、B诱导SL-1细胞类凋亡。首先，SL-1细胞经绿僵菌素A处理后，倒置相差显微镜观察发现，细胞膜收缩，细胞核固缩，并有明显的出泡现象和胞质外泄现象。20.0μG/ML绿僵菌素A处理SL-1细胞72 H后，细胞膜出现瘤状突起，并出现染色质凝结核，细胞大量死亡。绿僵菌素B同样可以引起SL-1细胞出泡、胞质外泄和细胞核固缩以及染色质浓集，但整个过程未见明显的凋亡小体。 ⑵绿僵菌素A和B对SL-1细胞表现出较好的增殖抑制活性，并能对SL-1细胞产生氧化损伤。绿僵菌素A处理SL-1细胞24 H的IC50为2.79μG/ML，48 H的IC50为1.65μG/ML，绿僵菌素B对SL-124 H、48 H IC50值要明显高于绿僵菌素A，分别为14.57μG/ML和10.34μG/ML，表明绿僵菌素A对SL-1细胞增殖抑制作用要比绿僵菌素B强。绿僵菌素A和B处理后的SL-1细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的相对含量随着绿僵菌素的处理浓度和处理时间的延长而下降，而丙二醛(MDA)含量显著升高。80.0μG/ML绿僵菌素A处理SL-1细胞24 H和48 H后，其还原型GSH的相对含量分别降低了54.73％和77.99％，MDA含量分别升高了3.00倍和4.62倍。而绿僵菌素B80.0μG/ML处理SL-1细胞24 H和48 H，其还原型GSH的相对含量降低了37.05％和68.22％，MDA含量分别升高了1.95倍和2.51倍。表明绿僵菌素A对SL-1细胞产生的氧化损伤要比绿僵菌素B强。 ⑶绿僵菌素A、B能对SL-1细胞膜结构产生显著影响，并影响其对大分子物质FD500的通透性。绿僵菌素A、B处理SL-1细胞12 H、24 H和48 H后，经环境扫描电镜观察，结果显示其细胞膜结构发生了显著变化。绿僵菌素A处理后细胞膜表面变光滑且微绒毛消失，细胞明显出现塌陷，穿孔，花样褶皱或皱缩，瘤状突起，甚至破裂死亡，并有大量小泡附着在细胞周围。随着处理浓度的升高，对细胞的损伤加重。其细胞膜对大分子物质FD500的通透性经过先升高后降低又升高的过程，处理48 H后显著高于对照。绿僵菌素B处理后细胞形状也变得不规则，细胞膜表面变光滑且微绒毛消失，细胞明显出现内陷，穿孔，花样褶皱或皱缩，甚至破裂死亡。细胞内部有明显空泡，细胞器稀少。其对大分子物质FD500的通透性同样经历了先升高后降低又升高的过程，但对大分子物质FD500的通透性一直低于对照。 ⑷绿僵菌素A、B能引起SL-1细胞的信号转导发生紊乱。经FCM检测结果表明，细胞内CA2+浓度在低浓度绿僵菌素A(2.5μG/ML和5.0μG/ML)处理后始终高于对照，但高浓度(10.0μG/NL以上)处理后细胞内CA2+浓度变化出现先降低后升高的变化趋势。绿僵菌素B处理后的SL-1细胞，细胞内CA2+浓度变化出现先降低后升高的变化趋势，但与对照柏比其相对浓度变化较小。瞬态钙离子实验结果表明，100μG/ML和200μG/ML绿僵菌素A和200μG/ML绿僵菌素B处理后，细胞内CA2+浓度迅速上升，其后CA2+浓度紊乱，不再有恒定的基线。细胞膜电位在绿僵菌素A处理后经历了先降低后升高再降低再明显上升。且随着处理浓度的提高，细胞膜电位下降。绿僵菌素B处理SL-1细胞后，细胞膜电位经历了先降低后升高再降低的过程。处理浓度与细胞膜电位之间规律不明显。细胞线粒体跨膜电位在绿僵菌素A处理后经历持续升高后降低的过程。而绿僵菌素B处理后，细胞线粒体跨膜电位经历了先降低后升高过程。到处理后期，高浓度处理线粒体跨膜电位明显升高，低浓度处理线粒体跨膜电位恢复正常水平。细胞线粒体MPTP通透性在绿僵菌素A、B处理后经历了先降低后升高再降低的过程。细胞内ROS含量在绿僵菌素A处理后经历了先升高然后保持，再降低的过程，其与对照含量的相对百分数随处理浓度的升高而降低。绿僵菌素B处理SL-1细胞后细胞内ROS的相对含量经历了先升高后降低再升高的过程，但与处理浓度之间关系不明显。瞬态ROS浓度实验结果表明，经绿僵菌素A、B处理后的SL-1细胞内ROS浓度迅速升高，其后急剧下降到起始值以下，并稳定在较低水平。总之，SL-1细胞经绿僵菌素A、B处理6H、12 H、24 H、48 H后，细胞内CA2+浓度、细胞膜电位、线粒体跨膜电位、线粒体通透性转换孔道(MPTP)、胞内ROS浓度均发生紊乱，大部分呈先失衡，小幅度恢复再失衡的趋势。 ⑸绿僵菌素A、B均能引起SL-1细胞的细胞周期结构变化。绿僵菌素A、B处理SL-1细胞的细胞周期主要阻滞于G2/M期，细胞DNA受损情况随着处理时间的延长而加重。绿僵菌素A高浓度处理后G0/G1期和S期细胞有所增加，表明高浓度绿僵菌素A对细胞抑制作用加强，使细胞停滞在特定时期。绿僵菌素B对细胞周期影响要低于绿僵菌素A。

关 键 词： 农业害虫 斜纹夜蛾 生物防治 绿僵菌素

分 类 号： [S433.4 S476.12]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]