导　　师： 张桂红

学科专业： I0602

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒，现已知有PCV1和PCV2两种基因型。PCV1为非致病性PCV；PCV2具有致病性，与猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、先天性震颤(CT)、猪间质性肺炎(IP)、猪皮炎肾炎综合症(PDNS)等有关。PCV2主要侵害5～16周龄的仔猪，引起仔猪渐进性消瘦、呼吸急促或困难、腹泻、贫血、皮肤苍白和全身淋巴结肿大，导致断奶后与生长期的猪生长迟缓及高死淘率，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。 本研究参照GENBANK中已发表的PCV2全基因组序列，设计合成两对引物，利用PCR方法扩增分离毒株GZ株、HN株、GD1株和GD2株全基因组，将PCR产物纯化后克隆到PMD18-T载体中，PCR鉴定阳性后进行序列测定，应用DNASTAR分析软件与GENBANK中已发表的其他毒株序列进行核苷酸及其氨基酸相似性比较，结果表明GZ株、HN株、GD1株和GD2株全长分别为1767BP、1768BP、1767BP、1767BP，与世界各地的PCV2全基因组序列核苷酸相似性在93.1％～99.9％之间，世界范围内PCV2毒株之间差异不大。而4个PCV2分离株之间全序列核苷酸相似性为97.1％～98.6％，与欧、美部分毒株亲缘关系较近。 本研究通过设计引物，优化LAMP反应体系和反应条件，成功建立了PCV2的LAMP检测方法，PCV2 LAMP在63℃1H内能够成功的检测猪圆环病毒2型病毒；其敏感度可以达到10个拷贝的PCV2 DNA，LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段，在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有较强优势。 本研究设计PCV2 TORF2的原核表达引物，引入BAMHⅠ和XHOⅠ酶切位点，制备克隆质粒PMD18T-TORF2，经过测序将阳性质粒酶切，将酶切产物插入PET—32A，构建的表达质粒PET-TORF2转化ROSETTAⅡ感受态细胞并诱导表达，并对表达的外源蛋白做SDS-PAGE分析和WESTERN—BLOT分析，结果表明原核表达载体PET—32A能成功表达TORF2，重组蛋白能与猪PCV2多抗血清发生特异性反应，重组蛋白有良好的免疫原性。 本研究通过设计引物，引入相应的酶切位点，分别扩增出PCV2 ORF2和PRRSVORF5，制备克隆质粒，并经过测序及酶切，将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体PFVC，获得3种重组质粒PFVC—ORF2、PFVC—ORF5、PFVC—ORF5—ORF2。经过质粒PCR和测序鉴定后，将重组质粒PFVC—ORF2、PFVC—ORF5、PFVC—ORF5—ORF2分别转化带有杆状病毒骨架的DH10BACTME.COLI感受态中进行同源重组。挑出阳性克隆进行PCR鉴定后，提取高质量的重组杆粒RBACMID—ORF2、RBACMID—ORF5、RBACMID—ORF5—ORF2，经脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞，获取重组病毒RAC—ORF2、RAC—ORF5、RAC—ORF5—ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒RAC—ORF2、RAC—ORF5、RAC—ORF5—ORF2对BALB/C小鼠的免疫实验，结果显示RAC—ORF2、RAC—ORF5、RAC—ORF5—ORF2均能够刺激小鼠机体产生抗体，并能持续较长时间。

关 键 词： 猪圆环病毒 亚单位疫苗 核苷酸 基因组序列

分 类 号： [S858.28 S852.5]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]