导　　师： 张红卫

学科专业： G1008

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 山东大学

摘　　要： 头索动物文昌鱼代表从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段。文昌鱼躯体结构较脊椎动物简单，但其基本特征与脊椎动物的祖先极为相似，在胚胎发生及发育机制方面都与脊椎动物有很多相似之处，是研究脊椎动物形体模式发生机制进化的最佳模型。另一方面，从比较基因组的角度看，文昌鱼未曾经历脊椎动物中大范围的基因倍增，因此它也是研究动物发育机制、脊椎动物起源和进化的理想材料。目前对文昌鱼的研究已深入到分子水平，文昌鱼基因组测序也已经接近完成，已经报道的文昌鱼基因包括脊椎动物转录因子、生长因子、信号分子、结构基因和酶的同源基因等。随着分子水平研究的深入，我们对文昌鱼的发育机制与调控也有了进一步的认识。近些年的研究表明，对脊椎动物和与它亲缘关系接近的类群之间进行比较基因组分析、发育调控基因的系统进化分析以及比较发育生物学的研究，可以提供很多有关脊椎动物起源和进化的线索，进一步揭示进化过程中基因和发育调控是如何改变的。但是，由于文昌鱼取材困难，因而对其研究依然不够充分，有待于继续积累数据，从而开展广泛、系统、深入的研究。 柱头虫是在进化上位于无脊椎动物和脊椎动物之间的另一类重要代表动物。作为对此类在进化上有着重要地位的动物进行深入研究的开始，本论文对柱头虫进行了一系列形态学方面的研究，试图为确定柱头虫的分类地位和阐明脊索动物的进化提供资料，并为在柱头虫中开展分子生物学的研究奠定基础。 本论文主要报道了与文昌鱼背腹图式形成及神经发育相关的几个基因AMPHISOX1/2/3-LIKE，THYMOSIN-β4，HMGB，RACK1及在文昌鱼中新发现的TOLL-LIKE基因所进行的研究工作。论文还描述了柱头虫形态学研究的结果。 首先介绍了文昌鱼早期神经发育相关基因AMPHISOX1/2/3-LIKE。AMPHISOX1/2/3-LIKE基因的演绎蛋白与佛罗里达文昌鱼AMPHISOX1/2/3的一致性最高，为64﹪，与海胆、海鞘、囊舌虫、蝾螈、斑马鱼、鸡、小鼠和人的SOX或是SOX1，SOX2和SOX3的一致性分别在36﹪-57﹪之间。然而在其多肽链的C端，文昌鱼缺乏一段50多个氨基酸的区域，而这一区域在脊椎动物的各个物种之间则是比较保守的。构建的进化树显示，SOX基因家族的进化规律符合动物分类学中各物种的进化地位。青岛文昌鱼和佛罗里达文昌鱼AMPHISOX1/2/3，以及海鞘SOX基因在进化上非常接近，它们可能歧化于脊椎动物SOX基因出现多态性和基因倍增之前。 胚胎原位杂交的结果显示，AMPHISOX1/2/3-LIKE基因的表达最早出现在原肠胚早、中期背部上胚层细胞中，表达区域包括预定神经外胚层。从早期神经胚开始，表达区域便明显地局限于背部神经外胚层中，在整个神经板中都有很强的表达。到了神经板边缘开始向背部翻卷时，表达区域随之向两侧分离。在神经管形成过程中，其表达区域主要位于神经管和躯体中、后部形成中神经管的两侧，表达的水平从前向后逐渐下调。到18H神经胚期时，AMPHISOX1/2/3-LIKE在神经系统中的表达仅存在于躯体后部的神经管中；同时，在背部消化道壁中也开始检测到表达信号。此后，该基因在神经管中的表达便停止了，但是在消化道壁中仍然维持表达。在20H幼虫的消化道壁中表达较强，随后表达从后向前下调，逐渐集中于咽鳃区。至48H幼虫时，已完全检测不到AMPHISOX1/2/3-LIKE的表达。研究结果显示，文昌鱼AMPHISOX1/2/3-LIKE基因的结构特征和表达图式与脊椎动物同源基因相似，它与文昌鱼神经组织的发育过程密切相关，可能在文昌鱼神经分化和消化道分化中起着重要的作用。 本论文首次在成体文昌鱼组织中研究了THYMOSIN-β4，AMPHIHMGB和AMPHIRACK1三个基因的表达情况。我们此前的研究工作显示，这三个基因在文昌鱼的胚胎发育过程中，都与神经系统发生和消化道分化相关。然而对这些基因在成体文昌鱼神经系统、消化系统以及其它组织器官中的功能还缺乏系统的分析。本部分工作采用组织学切片原位杂交和RT-PCR方法研究了上述三个基因在成体文昌鱼中的表达图式。原位杂交结果显示，在神经系统中，THYMOSIN-β4基因在脑泡和神经索中的神经元细胞核和神经胶质细胞中，在神经索的背、腹神经根中都有明显的表达，在神经索背侧正上方的嵴中也有较强的表达。AMPHIRACK1仅在文昌鱼脑泡和神经索中央管附近的神经元细胞核中表达，而在其它神经组织中则没有检测到它的表达信号。相反，AMPHIHMGB在神经索的外包膜中，在背、腹神经根和神经索背侧正上方的嵴中有明显的表达，而在神经元细胞核中只有低水平的表达。 此外，这三个基因也以各自特异性的表达图式在成体文昌鱼的其它多种器官组织中表达。在咽鳃区，THYMOSIN-β4和AMPHIRACK1在轮器中有明显的表达，而在这一器官中未检测到AMPHIHMGB的表达。在鳃中，这三个基因在鳃片的纤毛柱状上皮细胞、鳃片基部的鳃血管、隔膜腔、隔膜的骨轴中均有明显表达，但它们在这些不同结构中的表达部位和强度存在明显的差别。在内柱中，这三个基因在内柱的腺细胞、中央和侧面的纤毛细胞、内柱下腔、腔细胞、内柱骨板、内柱下腹部动脉以及其中的血细胞中也分别有其不同的表达图式。在消化道中，AMPHIRACK1在肝盲囊和肠的假复层柱状上皮整个上皮细胞中都有明显的表达；THYMOSIN-β4只在细胞质和绒毛中有较强的表达，而在细胞核中则表达较弱；AMPHIHMGB在这里的表达图式与THYMOSIN-β4相似，只是在表达水平上整体较低。在成熟的雄性精巢和雌性卵巢中，三个基因也各有其特异性的表达图式。 THYMOSIN-β4，AMPHIHMGB和AMPHIRACK1在成体文昌鱼中的表达图式与它们在脊椎动物中同源基因的表达图式相似。研究结果提示，在脊索动物的进化过程中，THYMOSIN-β4，HMGB和RACK1基因对于神经系统和其它器官的功能具有保守的作用。 本论文首次分别在核酸和蛋白水平上，系统地研究了文昌鱼中的TOLL-LIKE同源基因在胚胎发育和成体中的表达。根据佛罗里达文昌鱼一段与其它物种的TLR基因存在相似性的未知序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增出一段934BP的序列。测序后经比对，确定是TLR基因上的TIR区。以该序列为模板，标记探针。采用整体和组织学切片原位杂交、免疫组化、RT-PCR和WESTERNBLOTTING方法，在文昌鱼中研究了该基因在胚胎发育过程和成体中的时空表达图式。胚胎整体原位杂交的结果显示，文昌鱼TOLL-LIKE基因并没有明显的母源性表达。在原肠胚早期即将开始内卷的中内胚层细胞中首先检测到了TOLL-LIKE基因微弱的表达信号。随后，该基因表达迅速上调，在原肠胚中期整个分化中的中内胚层中都有很强的表达。神经胚早期，表达信号广泛出现在神经板、预定脊索板、分化中的中胚层和原肠消化道中。随着胚胎的发育和各组织器官原基的分化，表达区域逐步集中到形成中的神经管、脊索和初生体节中。到神经胚晚期，在神经管和体节中的表达开始下调，仅在胚胎中后部的神经管和尾芽处还能检测到表达信号；但在肌节腔壁、脏壁中胚层和消化道上皮中仍有明显的表达。幼虫期时，在体腔壁和肠壁中有强烈的表达，在尾部尚未完全形成的体节、内柱和背部血管中也可检测到表达信号。在整个胚胎发育过程中，始终未在表皮组织中检测到TOLL-LIKE基因的表达。胚胎整体免疫组化方法得到的结果显示，在胚胎发育过程中，文昌鱼早期卵裂期胚胎中有母源性的TOLL-LIKE蛋白的存在，在此后各发育时期，该基因在蛋白水平的时空表达图式与原位杂交所显示的表达图式是基本一致的。提取文昌鱼胚胎发育各时期RNA和蛋白进行RT-PCR和WESTERNBLOTTING分析所显示的结果也分别与原位杂交和免疫组化的结果是一致的。 组织学切片原位杂交结果显示，在成体文昌鱼中，TOLL-LIKE基因在神经索及其背侧的嵴中有显著的表达。在体表皮肤中表达明显，在肌肉中仅有微弱的表达，而在脊索中则完全没有表达。在咽鳃区部位，在轮器上皮细胞、咽上皮细胞，鳃片及内柱腺细胞中，TOLL-LIKE基因都有较为强烈的表达；在背部大动脉动脉腔中和体腔壁上附着的一些血淋巴细胞中也检测到了该基因的表达。在消化系统的肝盲囊和肠的假复层柱状上皮细胞中，TOLL-LIKE基因表达非常强烈。在雄性和雌性成熟的生殖腺中，TOLL-LIKE基因也有其特异性的表达图式。提取文昌鱼成体各组织的RNA进行RT-PCR分析显示的结果与原位杂交结果基本一致，WESTERNBLOTTING的结果同样表明，在成体文昌鱼中有很强的TLR抗体免疫阳性信号。 文昌鱼TOLL-LIKE基因在胚胎发育过程中的表达图式说明，这一基因在早期胚胎发育的原肠作用、胚胎的前—后和背—腹的特化中都起着重要的作用。它与神经管、脊索、体节、咽和肠等多种器官的发育密切相关，可能是个重要的母体效应基因。TOLL-LIKE受体在早期发育中的功能，在进化上既有保守性又有多样性。文昌鱼TOLL-LIKE基因在成体各组织中的表达图式也暗示文昌鱼的免疫系统也与TLR有着密切的关系。 论文的第五部分介绍了对半索动物三崎柱头虫的形态学研究工作。实验采用常规H·E·和三色染色切片的光镜观察，以及扫描电镜和透射电镜的观察，对柱头虫的各部分体段进行了组织学的系列研究，其中，对皮肤和生殖腺的研究最为深入细致。 本部分研究结果与头索动物文昌鱼进行比较，发现柱头虫多种组织的形态结构特点都与文昌鱼相似。

关 键 词： 文昌鱼 发育相关基因 基因组测序 柱头虫 形态学 动物进化

分 类 号： [Q754 Q959.287]

领　　域： [生物学] [生物学]