导　　师： 杨志荣

学科专业： G1007

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 四川大学

摘　　要： 首先利用启动子探针型载体PSUPV4直接在大肠杆菌中克隆类产碱假单胞菌(PSEUDOMONAS PSEUDOALCALIGENES)基因启动子片段,获得具有强启动子的重组子PPA7.对PA7片段的序列分析发现其距5'端931BP-1091BP处具有原核生物典型基因启动子的保守结构-10区和-35区,以及翻译必需的SD序列和翻译起始位点等.分别设计正向引物FPPAL、FPPA2,反向引物RPPA1、RPPA2对PA7片段进行PCR次克隆后定向连接到PSUPV4的多克隆位点区并保证阅读框不变,得到三个次克隆重组子卡那霉素抗性测定发现次克隆重组子的抗性相似,为600 UG/ML左右,证明PPA7-2所克隆的5'端899-1120BP片段在大肠杆菌中具有启动子的功能,5'端1120BP后的片段缺失对启动子没有影响.5'端0.7KB片段缺失明显影响启动子活性,推测该片段可能对启动子具有增强的作用.应用电穿孔转化法将PPA7转入类产碱假单胞菌,卡那霉素抗性测定发现经过转化的类产碱假单胞菌卡那霉素抗性明显高于未经转化的类产碱假单胞菌,证明PA7片段在类产碱假单胞菌中具有启动子功能.克隆了类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因并对杀虫蛋白启动子及信号肽进行分析.通过生物信息学的方法将环状芽孢杆菌(BACILLUS CIRCULANS)C-2 CHI1几丁质酶序列及功能域进行分析,同时还利用二级结构预测(PHDSEC)预测、通过SIGNALP进行信号肽判断及剪切位点预测、DAS-跨膜预测,通过SWISSMODEL进行3D结构分析等生物信息方法对利用PA7启动子及杀虫蛋白基因启动子PSC的两种连接方式进行评估预测,两种连接方式基本上不会影响编码蛋白的空间结构,几丁质酶基因CHI1的信号肽序列在革兰氏阴性菌中不会改变其性质及剪切位点.因此在理论上两种连接方式可行的.通过使用引物设计软件PRIMER.5设计引物,在PCR扩增体系中添加DMSO,克服扩增中两端引物的TM值大的差别,成功扩增CHI、CSP、LQZ、PSC片段.以PLAFR3质粒�

关 键 词： 类产碱假单胞菌 基因启动子 基因克隆 几丁质酶 表达载体构建 三亲转化 分子鉴定 功能鉴定

领　　域： [生物学] [生物学]