导　　师： 乔传令

学科专业： G1002

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 中国科学院动物研究所

摘　　要： 小菜蛾(PLUTELLA XYLOSTELLA)是危害十字花科蔬菜的主要害虫,近年来,小菜蛾对包括生物杀虫剂苏云金杆菌BT在内的多种杀虫剂及常用的有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯等杀虫药剂产生了抗药性.研究表明,小菜蛾抗药性的产生涉及多功能氧化酶系(MFO)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)的活性增高、乙酰胆碱酯酶(ACHE)的敏感性降低等.有关小菜蛾抗药性的研究,国内外大多集中在研究小菜蛾抗药性的监测以及抗药性的生化机制方面,有必要在分子水平上开展小菜蛾抗药性机制的研究.本研究首先用SMART(SWITCHING MECHANISM AT 5′END OF RNA TRANSCRIPT)技术构建了一个小菜蛾定向克隆的、全长CDNA文库.用已知昆虫的P450基因的相对保守序列MYYLDC(M)和P450血红素结合部位(GPRNCI)设计RT-PCR上下游引物,这对简并引物的序列为:5′-ATGACITA(TC)(TC)TIGA(TC)(TA)-3′和5′-AT(AG)CA(AG)TT IC-(GT)IGGICC-3′.通过RT-PCR,得到了一个小菜蛾P450的基因片段,用于文库的筛选.利用RT-PCR得到的小菜蛾的P450基因片段的有关信息,设计一对特异引物,引物序列为:5′-GCTAATGAGGCACTGAGGAAGTGGT-3′和5′-ATGCAATTCCTAGGTCCAGTTCCAA-3′.用这对引物对上述文库进行PCR筛选,经过对40个亚文库的筛选,得到了一个阳性克隆,然后将阳性克隆经过重组酶介导的位点特异性重组,使阳性噬菌体重组子转变为阳性质粒,然后进行测序,成功地得到了一个小菜蛾的P450 CDNA全长基因.通过分析发现,CYP9G2编码一个由521个氨基酸残基组成的蛋白质,预计分子量为59.9KDA,等电点为7.73.用有关生物学软件进行预测,得知该蛋白质的N端有一17个氨基酸残基组成的信号肽,其中的13个为疏水性氨基酸残基,和该蛋白质锚定于双层脂质膜有关,由此可以判断其为微粒体细胞色素氧化酶,这个结构特点是所有真核生物微粒体细胞色素氧化酶的共同特点.该蛋白质的C端,也就是第458至471位氨基酸残基为FG/S<'*>G<'*>R<'*>C<'*>G<'***>A/G,是血红素的结合域(HEME-BINDING MOTIF),该保守结构是所有P450酶系的共同特点.其中在所有P450都严格保守的半胱氨酸是血红素铁的轴配体,和P450在450NM处的吸收峰直接相关.通过已知的CYP9G2的CDNA序列,设计特异引物,用PCR对基因组进行扩增,成功地对小菜蛾CYP9G2的基因组结构进行了分析.通过使用引物延伸实验,对CYP9G2基因的转录起始点进行了定位.酯酶是昆虫的一种重要的解毒酶.为了克隆小菜蛾的酯酶基因,本研究根据已知昆虫的酯酶蛋白质的保守性氨基酸序列EDCLYLN和FGESAG,设计了一对简并引物,上游引物为:5′-GA(A/G)GA(C/T)TG(C/T)CT(A/G/T/C)TA CCT(A/G/T/C)AA-3′,下游引物为:5′-CC(A/G/T/C)GC(A/G)CT(C/T)TC(A/G/T/C)CC(A/G)AA-3′.通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出小菜蛾酯酶基因片段,然后按照测序结果再设计一对特异引物,利用PCR方法,筛选小菜蛾的CDNA文库.将RT-PCR获得的一条长度为330BP的目的条带,亚克隆入T-载体,测序结果表明共得到了10个不同的酯酶基因片段.利用其中一条酯酶序列设计一对特异引物,对小菜蛾的CDNA文库进行了初筛,显示文库中存在有小菜蛾酯酶基因.本研究通过构建小菜蛾CDNA文库,克隆了小菜蛾CYP9G2基因,并对其5′端转录起始点进行了定位,克隆了5′上游序列,对其基因的结构进行了分析,并对其表达进行了初步研究.通过对小菜蛾CYP9G2基因的研究和酯酶基因克隆,为探讨小菜蛾抗药性的分子机制进奠定了一定的理论基础.

关 键 词： 小菜蛾 酯酶 外显子 内含子 转录起始点 上游调控序列 共表达

分 类 号： [S433.4 Q756]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [生物学]