导　　师： 鞠熀先

学科专业： G0302

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 南京大学

摘　　要： 电化学免疫分析，特别是相应的安培免疫传感器，将抗体-抗原反应的高亲合性和分子识别能力与电化学测定的灵敏性、方便性结合，具有分析灵敏度高、特异性强、实时输出、使用简便及成本低等优点，在临床诊断、药物分析、环境和食品质量监控与处理等方面得到广泛应用。构建高效、自动化的免疫分析方法，发展便携、快速、可靠和廉价的微型化免疫分析仪器与免疫传感器件已成为生物分析化学中重要的研究领域之一。电化学免疫传感技术的核心之一是电极表面仿生功能界面的构建，即免疫分子的固定化。自组装技术是制备超薄有序膜的一种常用技术，该技术克服了以往吸附法、共价键合法以及聚合物涂层法等修饰方法不能完全控制分子取向或膜排列的问题，可以在分子水平上按人们预期的目标精确控制界面性质。 本文围绕自组装单层电化学及新型免疫传感研究这一中心，开展了以下几个方面的工作：1、自组装单层界面β-环糊精非电活性客体的电化学测定提出了用电化学手段测定非电活性物质的新方法。利用合成的β-环糊精对甲苯磺酸基衍生物(TS-β-CD)获得新型β-CD单层。虽然β-CD的覆盖率只有10％左右，但该单层对二茂铁表现出有效的主客体响应。界面上二茂铁的包络符合LANGMUIR吸附响应。利用LANGMUIR吸附等温式，得到二茂铁与β-环糊精形成包络物的包络常数为4.2×104L/MOL，二茂铁在该单层上的最大表面覆盖度为8.6×10-12MOL/CM2。当二茂铁溶液中含有非电活性物质间甲苯甲酸(MTA)或十二烷基磺酸钠(SDS)时，MTA和SDS与包络在电极表面的二茂铁发生客体竞争反应而使二茂铁的氧化还原峰电流降低。利用该原理，分别测定了非电活性物质MTA和SDS，线性范围分别为0.8-2.7μMOL/L和5-100NMOL/L。 2、链长对ω-羧基硫醇自组装单层表面性质影响的研究利用自组装技术在金电极表面分别制备了巯基乙酸(THIOGLYCOLICACID)、巯基丙酸(3-MERCAPTOPROPIONICACID)、ω-巯基十一酸(11-MERCAPTOUNDECANOICACID)、ω-巯基十六酸(16-MERCAPTOHEXADECANOICACID)和11，11’-二硫代双十一酸(11，11’-DITHIOBISUNDECANOICACID)等自组装单层。用电化学滴定方法测得这些自组装单层表面ω-端羧基的表面PKA分别为6.1、5.3、7.3、7.9和7.3，并利用这些结果系统地研究了链长对ω-羧基硫醇自组装单层表面PKA的影响。自组装单层性质对电活性探针的异相电子传递速率(KS)有很大影响。利用FE(CN)63-为电活性探针，通过循环伏安法测得碳链数为2、3、11和16的ω-羧基硫醇自组装单层在电化学滴定拐点处PH值时的异相电子传递速率常数分别为7.4×10-3、4.6×10-3、4.4×10-3和2.6×10-3CM/S。同时，讨论了浸泡时间对自组装单层形成的影响，并通过11，11’-二硫代双十一酸和ω-巯基十一酸自组装单层具有相同的表面PKA和KS说明它们具有相同的表面性质，形成的是相同的单层膜。 3、硫堇单层修饰金电极上CEA的电化学免疫分析提出了一种新颖的基于硫堇单层修饰金电极测定人血清中CEA水平的免疫分析方法。该硫堇单层修饰金电极通过对苯二甲酰氯为桥联剂，将硫堇分子共价键合到金电极表面的半胱胺自组装单层上制备而成。硫堇在该金电极上的表面覆盖率为(8.97±3.28)×10-12MOL/CM2。电极表面固定化硫堇的电化学行为表现出表面控制过程，其平均电子传递速率为1.47±0.84S-1。结合电化学酶联免疫分析法，利用电极表面固定化的硫堇为CEA抗体上标记的HRP与电极之间电子传递的媒介体，在含有2.0MMOL/LH2O2和0.5MOL/LNACL的PH4.2磷酸盐缓冲溶液中，获得CEA的测定校正曲线，其线性范围为0.6-17和17-200NG/ML，检测限为0.2NG/MLCEA。该传感器表现出很好的准确性、精确性和制备重复性。测定10和100NG/MLCEA时的组内变异系数分别为4.9％和5.9％，测定100NG/MLCEA时的组间变异系数为7.8％。该硫堇修饰金电极连续扫描100次后，响应只降低了1.6％，它可在4℃条件下于PH7.0的磷酸盐缓冲溶液中保存一周以上，说明该传感器具有很好的稳定性。该方法避免了常规免疫测定中电子媒介体的加入步骤，简化分析步骤，缩短分析时间。该方法对癌症及其转移的诊断和检测具有一定的价值。 4、准无媒介体免分离安培免疫传感器及CEA的快速测定构建了一种新颖的免分离无媒介体快速测定人血清中CEA含量的安培免疫传感器。该免疫传感器是利用戊二醛(GA)作为交联剂，通过同时固定电子媒介体硫堇和HRP标记CEA抗体于玻碳电极(GCE)表面制备而成。固定在电极表面的硫堇的电化学行为表现出表面控制的电极过程，其平均电子传递速率为4.74±2.99S-1。固定化硫堇可被用作标记在CEA抗体上HRP的电子传递媒介体。当该免疫传感器在含CEA样品的溶液中于23℃温育40分钟后，CEA与HRP标记CEA抗体的免疫结合导致标记HRP的活性中心与媒介体硫堇之间的电子传递被部分阻碍，使标记HRP对H2O2电催化氧化的效率降低。恒电位-300MV，催化效率的降低与CEA浓度在0.5-3.0NG/ML和3.0-167NG/ML成线性关系。优化的测定条件下，获得CEA免疫分析的检测限为0.1NG/ML(3σ)。该免疫传感器表现出很好的精确性和较好的准确性、制备重复性和贮存稳定性。在CEA浓度为2.5和50NG/ML时测定的组内变异系数分别为6.1％和5.8％，浓度为50NG/ML时测定的组间变异系数为6.3％。该方法降低了检测成本，缩短了分析时间，是一种在临床上非常有实用价值的免疫分析方法。 5、基于辣根过氧化酶直接电化学行为的无试剂CA125安培免疫传感器提出了一种新颖的免疫分析方法并构建了无试剂免疫传感器。该方法通过固定抗原分子，利用抗体上标记的辣根过氧化酶的直接电化学信号直接进行测定。利用CA125为模型分子，发展了无试剂CA125安培免疫传感器。该免疫传感器是利用TIO2溶胶-凝胶气相沉积技术将CA125抗原分子固定在玻碳电极表面制备而成。该CA125免疫传感器在含有HRP标记CA125抗体的磷酸盐缓冲溶液中温育后，HRP标记抗体与免疫传感器表面固定化CA125抗原分子免疫结合而连接在电极表面形成一层HRP修饰膜。该固定化的HRP表现出直接电化学行为，其电子传递速率为3.04±1.21S-1。结合竞争免疫分析，利用示差脉冲伏安法测定竞争免疫结合后HRP直接电化学峰电流的降低间接测定出样品中CA125含量。溶液中CA125抗原分子和传感器表面固定化CA125抗原分子竞争结合溶液中—定量的HRP标记CA125抗体导致了该电流的降低。在优化的实验条件下，样品中CA125浓度在2-14U/ML范围内与电流降低成线性关系，通过测定电流下降10％时相应CA125的含量，获得该方法的检测限为1.29U/ML。该免疫传感器表现出很好的准确性、精确性。其测定组内变异系数在8和14U/ML时分别为8.7％和5.5％。而在8U/ML时测定的组间变异系数为19.8％，说明该传感器具有较好的制备重复性。该传感器具有较好的稳定性，可以在磷酸盐缓冲溶液中稳定存放15天。该方法的提出为临床免疫分析提供了一种非常有前景的方法。 6、一次性免分离肿瘤标志物快速测定免疫芯片针对血清肿瘤标志物的临床免疫测定，将化学修饰、微加工和丝网印刷等技术与临床化学、肿瘤免疫学有机结合，发展了一次性免分离快速测定免疫芯片。利用微加工技术制备环形碳电极，通过化学修饰技术将媒介体硫堇固定在该环形碳电极内表面，并创新性地将该媒介体修饰环形碳电极的内腔直接作为微反应池。整合参比电极和对电极于反应池上盖，结合竞争免疫分析，酶标记抗体与待测抗原结合生成的免疫结合物游离在反应池中，利用测定游离免疫结合物上标记酶电催化氧化H2O2的催化电流，直接获得待测抗原的含量。该免疫芯片的测定无须任何分离、洗涤步骤，分析时间短，操作方便，不仅在理论上为肿瘤标志物的免分离快速测定建立一新方法，而且，该芯片制备简单，成本低廉，携带方便，性能稳定，适合于免疫传感器件的迫切需求，因而具有市场竞争力。

关 键 词： 电化学免疫分析 安培免疫传感器 生物传感器 免疫传感器 电化学滴定 酶联免疫测定 放射免疫测定 傅立叶变换红外光谱 射线光电子能谱 电活性客体电化学测定

分 类 号： [O65 Q939.91]

领　　域： [理学] [理学] [生物学]