导　　师： 曾振灵

学科专业： I0601

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 伴随着抗菌药物的广泛使用，耐药菌株迅速出现，多重耐药现象十分普遍，已引起了全球的关注。FQS(FLUOROQUINOLONES)类药物作为广谱抗菌药物，广泛用于感染性疾病的控制。目前病原微生物对该类药物耐药已相当严重。细菌因编码靶酶的基因(GYRA、PARC、GYRB及PARE)发生突变导致酶结构的改变是产生FQS耐药的主要机制。 随着分子生物学技术发展，许多分子生物学方法在临床医学得到了广泛应用。基因芯片技术作为一项高新技术，也逐步在微生物鉴别及耐药性检测方面显示出高通量、并行性、微型化及自动化应用前景。目前国内外学者都在致力寻找控制耐药菌株扩散和耐药性蔓延的策略，对全球细菌耐药状况进行监控，基因芯片技术无疑为兽医临床检验进行耐药性监测和病原菌鉴定提供了一项快速有效的检测技术。本研究尝试性地制备了微生物诊断芯片和FQS耐药检测芯片，对临床分离菌及其对QS(QUINOLONES)类药物耐药性进行了检测。研究分4部分完成。 1不同种类微生物耐药性监测 在我国主要畜禽养殖地区较大规模收集大肠杆菌、沙门氏菌及鸡毒支原体样品。动物来源包括鸡、鸭、鹅及猪。用微量肉汤稀释法对来自不同地区不同动物源588株大肠杆菌、217株沙门氏菌和33株鸡毒支原体进行了常用抗菌药物敏感性试验，按NCCLS标准进行耐药性判断。结果显示：大肠杆菌对12种QS药物耐药率超过50％。对其他8种抗菌药物耐药也十分严重，其中对阿莫西林、四环素、多西环素，卡那霉素、新霉素及甲砜霉素耐药率接近或超过50％。多重耐药十分普遍，多重耐药类型主要为15～19耐。不同动物源、不同地区分离菌株对20种抗菌药物耐药分布状况大体一致；沙门氏菌对20种抗菌药物除阿莫西林、氟甲喹、萘啶酸、培氟沙星及四环素耐药率接近或超过50％外，对其余15种药物仍保持敏感。在耐药沙门氏菌株中，主要呈多重耐药，多重耐药类型为3～6耐；鸡毒支原体对6种FQS药物耐药率已超过50％。对大观霉素、红霉素、罗红霉素及泰乐菌素耐药率已超过50％，对多西环素和替米考星保持敏感。在耐药鸡毒支原体中，主要呈多重耐药，多重耐药类型以6、7、8及10耐为主。 2耐氟喹诺酮类药物菌株基因突变研究 采用PCR方法扩增大肠杆菌GYRA、PARC、GYRB及PARE基因QRDRS(QUINOLONERESISTANCE-DETERMININGREGIONS,QRDRS)，沙门氏菌GYRA及PARC基因QRDRS，鸡毒支原体GYRA基因QRDRS，并对PCR产物进行测序，比较分析各基因碱基突变及相应氨基酸取代情况。结果显示：大肠杆菌GYRA发生83TCG→TTG、87GAC→AAC，PARC发生80AGC→ATC基因突变为热点突变，导致氨基酸取代为GYRAS83→L，D87→N，PARCS80→I，在GYRB及PAREQRDRS未发生氨基酸取代；沙门氏菌GYRA发生83TCC→TTC，87GAC→AAC为热点突变，PARC很少发生突变，导致GYRA氨基酸取代为S83→F，D87→N；鸡毒支原体GYRA发生83AGT→ATT，87GAA→GGA为热点突变，GYRA氨基酸取代为S83→I，E87→G；无论大肠杆菌、沙门氏菌还是鸡毒支原体，其靶酶氨基酸取代数量与FQS耐药表型相关。 316SRDNA基因芯片制备及应用 对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌及鸡毒支原体16SRDNAV1-V3进行了扩增、转化及测序；制备了16SRDNA克隆探针，与16SRDNA诊断芯片进行杂交；对基因芯片体系进行了特异性及灵敏性检测，并进行了芯片对临床分离菌株及混合菌株样品检测正确率测试。结果显示：16SRDNA基因芯片除检测大肠杆菌、沙门氏菌特异性差外，对其他细菌检测特异性高；检测体系灵敏度达3PG/μL；对临床分离金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及鸡毒支原体单样和混合样进行了检测，正确率达100％，但不能正确检测大肠杆菌、沙门氏菌临床分离样本。 4寡核苷酸芯片检测FQS耐药基因突变 设计了针对GYRA、PARC基因突变型及野生型13条寡核苷酸探针，将这些探针点阵于芯片上，制备了FQS耐药检测基因芯片。样品通过PCR方法进行荧光标记，标记样品与芯片在严紧性杂交条件下杂交。结果显示：FQS耐药性检测芯片用于样品GYRA及PARC基因突变检测是可行的，芯片检测结果与测序结果符合率为75％。

关 键 词： 病原微生物 耐药性 基因突变 诊断芯片 耐药性检测芯片 抗菌药物

分 类 号： [S859.79]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学]