导　　师： 余蓉

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 四川大学

摘　　要： 几丁质是产量仅次于纤维素的第二大类多糖。壳聚糖是几丁质的脱乙酰产物。壳聚糖降解后产物壳寡聚糖具有较高的溶解性和生理活性，在食品工业、农业、医疗方面有着广泛的应用价值。目前，酶解法生产壳寡聚糖成为研究热点，其中以专一性的壳聚糖酶降解壳聚糖的研究进展最快。但是目前发现的菌株壳聚糖酶产量较低，生产成本较高，且酶的稳定性方面还有较多缺陷，不能适应大规模工业生产的需要。因此，筛选产壳聚糖酶能力更强的菌株，寻找具有工业化潜在应用价值的新酶源，仍是目前研究的一个重要方向，有着很大的应用研究价值。 本研究比较几种丝状真菌产的活力大小，筛选出产酶活力最高的贵州绿僵菌AS3.4608。通过对贵州绿僵菌固态发酵条件的研究，确定了最佳发酵条件为：当以麸皮：黄豆粉为1：3作为培养基，添加1％壳聚糖，最适氮源为1‰KNO3，起始PH为5.6，发酵温度为27℃～28℃，接种量为3ML，培养120小时产酶活力最高。此外，添加稻壳对其产酶有促进作用。添加氨基葡萄糖对菌株生长有促进作用，但是对产酶有抑制作用。该菌株在发酵120H时，每克干培养基酶活力可达83.09±2.9U。 本文用缓冲液对发酵后培养基进行抽提，采用PEG6000和丙酮分级沉淀，DEAE-SEPHAROSEFF、CM-SEPHAROSEFF、SUPERDEX75层析得到了活性较高的壳聚糖酶。经SEPHACRYLHR200层析、SDS-PAGE证实为纯品单亚基蛋白，比活达102.65U/MG。每克干培养基可获壳聚糖酶328UG，纯化活性回收率为47.44％，酶蛋白分子量为50.3KD，国内外未见报道。对样品理化性质研究表明，该酶在45℃以下有较好的稳定性，在弱酸性(PH5.0-7.0)的溶液中也相当稳定。保温LH，酶的半失活温度为48℃。该壳聚糖酶降解壳聚糖反应最适温度为50℃，最适PH为4.0。其米氏常数KM值为2.718G/L，VMAX为1.152×10-2G·L-1·MIN-1。HG2+对该酶有强烈抑制作用，MN2+、MG2+、ZN2+、FE3+、AG对该酶有较强抑制作用，CU2+对其有较强激活作用。该酶是一种糖蛋白，含糖量约为26.33％。该酶不能降解片状甲壳素和纤维素，能够微弱降解CMC和胶体甲壳素，最适底物为脱乙酰度为90％的胶体壳聚糖。

关 键 词： 绿僵菌 固态发酵 壳聚糖酶 分离纯化

分 类 号： [Q556]

领　　域： [生物学]