导　　师： 王锋

学科专业： I0501

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 南京农业大学

摘　　要： 　　本试验以屠宰场废弃牛卵巢为材料，从卵巢表面直径在2～8MM的卵泡中抽取卵泡液，并从卵泡液中分拣出外被多层卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体(COCS)作为研究的对象。本试验首先对影响牛COCS冷冻的一些因素进行了探讨，然后用荧光染色的方法分析了冷冻对COCS减数分裂进程的影响。1影响牛COCS冷冻保存的一些因素的研究 　　试验首先在简化牛COCS体外成熟的基础上分析了保护剂、平衡温度、预平衡方法、解冻方法以及冷冻方法对牛COCS冷冻的影响。结果表明：(1)在体外成熟培养液中添加26.2MM的NAHCO3和对屠宰场卵巢进行一定的选择更能促进牛COCS的体外成熟；(2)无论是程序冷冻还是玻璃化冷冻，乙二醇(EG)与甘油(GLY)相比更能增强牛COCS的冷冻效果；(3)在程序冷冻中，冷冻液中添加0.1M的蔗糖比添加0.3M的蔗糖更能增强牛COCS的冷冻效果；(4)在玻璃化冷冻中，38.5℃和25℃的平衡温度比4℃更适合牛COCS的冷冻；(5)在10﹪、5﹪、1﹪的预平衡浓度之间，5﹪的预平衡浓度即可达到预平衡的效果；(6)在解冻时，多步脱除保护剂较一步脱除法更能保护冷冻后的COCS。 　　试验通过荧光染色的方法建立了卵母细胞在体外培养过程中第一次减数分裂的各个阶段的判断标准；然后根据这个标准来观察GMP玻璃化冷冻对卵母细胞第一次减数分裂进程的影响。说明从屠宰场获得的卵母细胞有较高的异质性。体外培养8H后，冷冻组到达中期(MⅠ)的卵母细胞显著少于对照组(未冷冻组)(P＜0.01)，其他阶段的卵母细胞没有显著的差异；体外培养15H后，冷冻组显著低于对照组，另外，对照组有36.11﹪的卵母细胞到达了后期(AⅠ)和第二次减数分裂中期(MⅡ)，而冷冻组仅6.67﹪的卵母细胞到达MⅡ期。体外培养22H后，对照组中有55.56﹪的卵母细胞处于MⅡ期，极显著高于冷冻组，而冷冻组中24.32﹪的卵母细胞停止于浓缩期，显著高于对照组的5.56﹪(P＜0.05)。从两组第一次减数分裂的差异可以看出，冷冻不影响正常的生发泡破裂，但大多冷冻的卵母细胞无法完成浓缩期向MI期的过渡，这可能是导致核成熟率显著下降的原因，因此，GMP玻璃化冷冻对减数分裂的影响发生在中期染色体的形成阶段。

关 键 词： 牛卵巢 卵泡卵母细胞 冷冻 减数分裂

分 类 号： [S823.34 S814]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]