导　　师： 庞义

学科专业： G1005

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 中山大学

摘　　要： 目前，害虫对转入苏云金芽胞杆菌(BACILLUS THURINGIENSIS，BT)δ内毒素基因的转基因抗虫植物产生抗性的问题越来越受到人们的关注。寻找新型杀虫毒素基因，开发表达新毒素或共表达多个杀虫毒素的新型抗虫作物有助缓解害虫对转BT基因抗虫作物的抗性压力，扩大转基因抗虫作物的抗虫谱。昆虫病原线虫共生菌是存在于这类线虫肠道内与之互惠共生的细菌。近期研究发现这类细菌能够分泌多种杀虫毒素，是继苏云金杆菌之后开发转基因抗虫植物的毒素基因源。本研究从昆虫病原线虫共生菌PHOTORHABDUS LUMINESCENS YND185中克隆到一个新型杀虫毒素基因，命名为PHOTORHABDUS INSECTICIDAL TOXIN (PIT)并对其功能进行了初步研究；同时对本室先前找到的一个含TC类毒素基因、对棉铃虫(HELICOVERPA ARMIGERA)有口服杀虫活性的粘粒XNBP83的DNA序列进行测定与分析；并克隆和表达了PHOTORHABDUS SP.HB78 PLU0840基因。 PIT基因与P. LUMINESCENS TT01的未明功能基因PLU1537有94﹪DNA和98﹪氨基酸序列相似性。将PIT基因克隆到表达载体PGEX-4T-1上，并在E. COLI中进行表达，其表达产物主要以不溶的包涵体形式存在。用SKL溶解包涵体，并通过透析将包涵体蛋白溶解复性、浓缩，再用GST纯化试剂盒进行纯化。用凝血酶将融合蛋白GST-PIT的GST剪切后进行生物测定，口服PIT明显抑制了斜纹夜蛾(SPODOPTERA LITURA)和棉铃虫(H. ARMIGERA)的生长发育；血腔注射PIT引起大蜡螟(GALLERIA MELLONELLA)和斜纹夜蛾(S. LITURA)幼虫死亡，死亡率与注射剂量密切相关，LD<,50>分别为每头虫30和191NG。组织切片检查显示血腔注射PIT对大蜡螟幼虫中肠有破坏作用。用纯化的GST-PIT免疫家兔得到的多克隆抗体进行WESTERN BLOT分析发现，PIT在P.LUMINESCENS YND185内表达的蛋白90﹪以上分泌到细菌细胞外，可见，PIT是一个可溶的分泌蛋白。用PCR和WESTERN BLOT方法检测了27株共生菌中PIT基因及PIT蛋白，结果显示其中11株共生菌含有P打基因，18株共生菌检出GST-PIT杂交带，而所有P.LUMINESCENS共生菌均检出了PIT基因和PIT蛋白。对扩增出的PIT基因测序结果表明，各菌株PIT有94.4～100﹪ 核苷酸相似性和97.1﹪～100﹪的氨基酸相似性。 XNBP83是从X. NEMATOPHILUS BP基因组粘粒文库中筛选出的一个对棉铃虫有较强口服杀虫活性的克隆。本研究将XNBP83上清和沉淀饲喂棉铃虫(H.ARMIGERA)、甜菜夜蛾(S. EXIGUA)、斜纹夜蛾(S. LITURA)和粉蚊夜蛾(TRICHOPLUSIA NI)，结果表明XNBP83是对所测鳞翅目昆虫有广谱的杀虫活性。采用亚克隆结合PRIMER-WALKING DNA测序技术对粘粒XNBP83的插入片段进行测定。该插入片段全长38939 BP，共有11个ORF，其中包括5个与杀虫活性相关的TC类基因XPTA1、XPTB1、XPTC1、XPTA2、XPTD1。这五个基因的序列分析结果显示：①粘粒XNBP83中的XPTD1不完整，与X. NEMATOPHILUS PMFL296 XPTD1相应片段氨基酸序列有99﹪的相似性。②BPXPTA1读码框全长7569BP，编码2520个氨基酸，与PMF1296的XPTA1氨基酸序列有98﹪的相似性，两者在第2200-2223氨基酸区域连续有23个氨基酸不同。③BPXPTB1读码框全长3051BP，编码1016个氨基酸，与X. NEMATOPHILA另一地方株的XPTB1/TCCC1氨基酸序列的有99﹪的相似性，与PMF1296 XPTB1氨基酸序列有98﹪的相似性，在第620-650氨基酸之间，有28个氨基酸差异。④BPXPTC1读码框全长4225BP，编码1408个氨基酸，与PMF1296的XPTC1氨基酸序列有96﹪的相似性。前者的主要变异是：在BP的第232氨基酸后插入了一个TAQRYLAK的氨基酸序列；在第627-646氨基酸区域内，有18个氨基酸不同。⑤BP XPTA2读码框全长7574BP，编码2524个氨基酸，与PMF1296的XPTA2氨基酸序列有90﹪的相似性，在BP品系XPTA2的第788-855氨基酸和第1630-1784氨基酸有两个明显变异区。粘粒XNBP83中这五个与杀虫活性相关的基因均与P. LUMINESCENS的某些TC毒素基因有40﹪以上的相似性。 本研究从共生菌菌株PHOTORHABDUS SP.HB78中成功克隆和表达了全长PLU0840基因，表达的融合蛋白GST-PLU0840主要以不溶的包涵体形式存在，从E.COLI DE3中提取了包涵体，用变性剂SKL进行溶解，然后透析复性、浓缩、纯化后，经THROMBIN剪切，用于生物测定。结果显示，未除去信号肽的PLU0840蛋白对大蜡螟、斜纹夜蛾无血腔杀虫活性，但口服能抑制斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的生长。 本研究从共生菌菌P.LUMINESCENS YND185中成功克隆和表达了一个新的杀虫毒素基因PIT，测定了粘粒XNBP83全序列并对其基因结构以及与杀虫活性有关的基因进行了详细分析，克隆和表达了PHOTORHABDUS SP.HB78全长PLU0840基因。这些研究结果为进一步研究和开发利用昆虫病原线虫共生菌杀虫毒素打下了基础。

关 键 词： 昆虫病原线虫共生菌 杀虫毒素基因 转基因植物 抗虫植物

分 类 号： [Q939.1 Q943]

领　　域： [生物学] [生物学]