导　　师： 计亮年;王珣章

授予学位： 博士后

作　　者： ;

机构地区： 中山大学

摘　　要： 生物技术研究的最终目的是生产商业产品，而选择合适的表达系统表达外源基因则是生物技术产业化的基本前提。在众多表达系统中，真核表达系统由于具有卓越的翻译后修饰加工能力，因此非常适合用于研究蛋白的功能以及生物技术产业化的开发工作。然而，并非每种基因都适合在任何表达系统中进行表达，也就是说，如果外源基因不能够得到高效表达或是表达产物不具有生物活性，那么生物技术产业化也就无从论起。在实际应用过程中，用常规方法克隆到的、未经任何改造的基因有时很难找到合适的表达系统进行高效表达。尽管现在已有许多方法(例如：定点突变技术、PCR等)可以对基因的密码子进行改造以达到适合表达的目的，但相对来说都较为费时费力，如果要改造的密码子很多的话，工作量就显得更为突出。因此，采用人工合成基因的方法进行克隆具有其独特的优越性：(1)这种方法省时省力；(2)准确性达到100％；(3)可对密码子进行大规模修改，从而一次性完成对基因的改造；(4)人工合成时可以引入特定的信号肽序列，或是在载体本身的信号肽和外源基因之间消除多余的碱基，这样既可进行分泌型表达，为将来的中下游工作奠定基础，又能使信号肽被正确切割之后在重组蛋白的N端没有多余的氨基酸。最后这一点对于保证重组蛋白的正确折叠、乃至保证其生物活性都具有重要意义。 　　因此，本文通过引物设计、TAQ酶聚合反应(包括链延伸反应、PCR反应)等步骤，在对相关基因进行了重新设计和改造的基础上，用人工合成方式克隆了黑曲霉植酸酶基因、人白血病抑制因子基因、人神经多肽GALANIN基因和人肥胖基因；构建了植酸酶基因的酵母表达载体PPICZ-α-A-PHY、人白血病抑制因子基因的酵母非融合表达载体PPICZ-α-A-HLIF、人神经多肽GALANIN基因的杆状病毒转移载体PAC-GP67-A-GAL和人肥胖基因的哺乳动物细胞重组表达载体PIRESNEO-HOB；构建了可分泌表达植酸酶和人白血病抑制因子基因的非融合型酵母工程菌，SDS-PAGE和酶活检测显示基因工程植酸酶在酵母表达系统中得到了成功表达，在培养基上清中其酶活达到了1000U/ML，为重组植酸酶的产业化奠定了良好的基础；应用PCR突变技术成功构建了人白血病抑制因子基因C-端融合酵母表达载体PPICZ-α-A-HLIF’，同时亦构建了人GALANIN基因的PALTER-GAL重组突变载体，为下一步进行定点突变删除多余碱基打下了基础。

关 键 词： 真核表达系统 基因人工合成 植酸酶基因 人白血病抑制因子基因 人 基因 人肥胖基因 生物技术

分 类 号： [Q785 Q786 Q781]

领　　域： [生物学] [生物学] [生物学]