导　　师： 童光志

学科专业： I0602

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 本文针对乙型脑炎病毒的e基因和ns5基因，利用rna干扰技术研究了基于鼠源u6启动子和cmv启动子的短发夹rna干扰(shrna)表达载体对jev复制的抑制效果。成功构建了一系列jev微复制子表达系统，并以此为基础对jev的5’端非编码区和3’端非编码区的功能进行了初步研究。 在基于鼠源u6启动子的shrna表达载体的rna干扰实验中，选取4个针对jev结构蛋白e基因的靶位点e250、e576、e825和e1314，克隆到pegfp-n1载体，成功构建了shrna长效表达质粒pge250-shrna、pge576-shrna、pge825-shrna、pge1314-shrna和1个阴性对照质粒pgnc-shrna。将其转染bhk-21细胞，感染jev疫苗株sa14-14-2后24h，通过间接免疫荧光法、化学荧光法western blot、荧光定量rt-pcr等方法在rna转录水平及蛋白质表达水平检测，结果表明shrna表达载体pge576．shrna、pge825．shrna和pgel314-shrna都对jev的复制产生较强的抑制作用，其中pge825-shrna的抑制效果十分突出，在rna转录水平和蛋白质表达水平的抑制效率分别达到了93.1％和78.8％。 在基于cmv启动子的shrna表达载体的rna干扰实验中，选取4个针对jevsal4-14-2疫苗株ns5基因的靶位点ns5-201、ns5-455、ns5-699和ns5-804，克隆到以cmv启动子的shrna表达载体psilencer 4.1-cmv neo中，成功构建了shrna长效表达质粒ps4.1-ns5-201、ps4.1-ns5-455、ps4.1-ns5-699、ps4.1-ns5-804和阴性对照ps4.1-ns5-nc。同时，将ns5的部分基因(第181个核苷酸到第911个核苷酸)克隆到pegfp-n1多克隆位点处，按照读码框架与egfp基因的n端融合，获得重组表达质粒 pns5-egfp。将shrna重组表达质粒ps4.1-ns5-201、ps4.1-ns5-455、ps4.1-ns5-699、ps4.1-ns5-804和ps4.1-ns5-nc分别与融合表达质粒pns5-egfp共转染293t细胞，通过荧光显微镜观察、流式细胞术、荧光定量rt-pcr和化学荧光western blot检测结果表明，ps4.1-ns5-455、ps4.1-ns5-699和ps4.1-ns5-804 shrna表达质粒均能高效抑制ns5基因的表达，其中ps4.1-ns5-699的抑制效率非常显著，流式细胞术和荧光定量rt-pcr的抑制效率分别高达90.6％和94.7％。此方法可以作为快速高效筛选rna干扰靶位点的技术平台。将重组表达质粒ps4.1-ns5-201、ps4.1-ns5-455、ps4.1-ns5-699、ps4.1-ns5.804和ps4.1-ns5-nc分别转染bhk-21细胞，感染jev疫苗株sa14-14-2后24h，通过间接免疫荧光法、荧光定量rt-pcr和化学荧光法western blot检测对jev复制的抑制效果，实验结果与293t 细胞上的结果是一致的，其中ps4.1-ns5-699在rna转录水平和蛋白质表达水平的抑制效率分别达到了92.6％和80.5％。用rt-pcr方法分段扩增了jev sa14-14-2．疫苗株基因组5’端utr和3’端utr，为了确保不会引入任何多余核苷酸，利用融合pcr技术在5’utr和3’utr之间引入绿色荧光蛋白gfp，将5’utr置于cmv早期启动子控制之下，3’utr后面紧接具有自我催化功能的丁型肝炎σ核酶(ribozyme)结构，其后接着sv40 polya，然后克隆至pmd18-t载体上，成功构建表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体pwf-gfp，同时构建不含5’端utr和3’端utr的对照载体pnu-gfp，同等条件转染293t细胞和bhk-21细胞后，经荧光显微镜直接观察，都可以见到明显的绿色荧光，且pwf-gfp的荧光强度明显强于pnu-gfp的荧光强度，说明外源基因能够在哺乳动物细胞中高效表达，同时表明5’端utr和3’端utr可能对外源蛋白的表达有一定的促进作用。为了进一步研究jev非编码区的功能，本研究构建了一系列删除cmv启动子，保留部分5’端utr和3’端utr的微复制子表达系统，该系统仍然可以使gfp成功表达，结果表明3’端utr的部分核苷酸具有启动子活性。

关 键 词： 乙型脑炎病毒 病毒基因 干扰 复制

分 类 号： [S852.65]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学]