导　　师： 陈焕春

学科专业： I0602

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华中农业大学

摘　　要： 猪圆环病毒2型(pcv2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(pmws)，而且还与猪皮炎与肾病综合征(pdns)、猪呼吸道疾病综合征(prdc)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从20世纪90年代发现可致猪的疾病以来，pcv2病毒在世界各国迅速蔓延。目前pcv2在猪群中的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％，给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此，研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点，但目前对于pcv2的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。 本研究对pcv2新型疫苗设计进行了新的探索，构建了利用杆状病毒表达系统表达的orf2蛋白亚单位疫苗，修饰的orf2 dna疫苗以及杆状病毒为载体的重组毒疫苗，并对构建的候选疫苗进行了免疫效力研究，主要研究内容如下： 1．pcv2亚单位疫苗的构建以及免疫原性 研究pcr扩增pcv2 orf2全基因，并克隆到杆状病毒转移载体pfastbac<'tm>中，构建转移载体 pfast-orf2，然后转化dh10bac大肠杆菌，通过蓝白斑菌落及抗性筛选，获得重组穿梭载体rbac.orf2，提取其基因组并转染 sf9 昆虫细胞，获得重组杆状病毒ac-orf2。通过间接免疫荧光和 western blotting分析证明插入的orf2基因可在重组杆状病毒中进行有效表达，并证实该表达蛋白纯化后经磷钨酸负染后，电镜下可见形态与pcv2病毒粒子相似的病毒样颗粒(vlps)，其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣壳，其直为17nm。为了进一步研究病毒样颗粒的免疫原性，我们将此特性的orf2蛋白制备成亚单位疫苗，按照10<'6>个细胞/ml，5×10<'6>个细胞/ml 和10<'7>个细胞/ml 三个不同的剂量免疫28日龄断奶仔猪。试验结果表明，在首疫后第4周，5×10<'6>个细胞/ml和10<'7>个细胞/ml两个剂量组免疫的部分仔猪体内已有 orf2抗体产生，在加强免疫后该两组的抗体水平继续升高，但两组间差异不显著，而10<'6>个细胞/ml 免疫组在加强免疫之前和之后均检测不到orf2抗体的存在。淋巴细胞增殖试验结果也同样证实该5×10<'6>个细胞/ml和10<'7>个细胞/ml 免疫组的仔猪可以诱导较高的pcv2特异性的淋巴细胞增殖反应。表明杆状病毒表达的orf2蛋白具有良好的免疫原性，是一种极具潜力的pcv2候选亚单位疫苗。 2．修饰的pcv2 dna疫苗的构建以及免疫原性研究 研究证实将抗原靶向到不同的亚细胞器，能够影响此抗原的加工与提呈途径，进而改变此抗原诱导的免疫反应的类型。核定位的pcv2衣壳蛋白是否也会由于核内定位的模式而影响其抗原提呈，进而影响其免疫反应的诱导?因此本研究对orf2基因进行修饰，使所表达的orf2具有不同的定位模式，即核定位型的pc-orf2，胞浆定位型的cy-orf2，分泌型的sc-orf2和膜结合型的m-orf2。间接免疫荧光证实修饰后的orf2蛋白能够表达，并且能够正确靶向到各亚细胞器。以小鼠为模型动物，探讨了4种修饰的orf2 dna疫苗的免疫效力，实验结果表明：4种构建的dna疫苗均可以诱导一定程度的orf2特异的体液免疫反应，但相对于核定位型(pc-orf2)与胞浆定位型(cy-orf2)，分泌型orf2(sc-orf2)和膜结合型orf2(m-orf2)免疫小鼠能够诱导显著高的中和抗体水平。而从细胞免疫水平来看，膜结合型orf2 (m-orf2)免疫的小鼠诱导显著高水平的t淋巴细胞增殖活性及ifn-γ分泌水平，其次是核定位型orf2(pc-orf2)免疫的小鼠，而分泌型(sc-orf2)与胞浆定位型orf2(cy-orf2)免疫的小鼠仅诱导低水平的t淋巴细胞增殖活性及ifn-γ分泌水平。因此，综合体液免疫水平和细胞免疫水平，膜结合型orf2(m-orf2)能够诱导较高的中和抗体水平和最高的细胞免疫水平，具有最佳的免疫效果，是一种具有良好发展前景的pcv2新型候选疫苗。 3．杆状病毒介导的表达pcv2 orf2的重组毒疫苗的构建以及免疫原性的研究 杆状病毒不能感染哺乳动物细胞，但可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳动物细胞，并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。目前利用杆状病毒作为体内基因投送的载体已受到广泛的关注。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体内基因转导过程中的主要抑制因素。因此，为了消除杆状病毒的补体敏感性，在本研究中利用水泡性口炎病毒g蛋白修饰杆状病毒。pcr 扩增编码水泡性口炎g蛋白的vsv-g基因，克隆到杆状病毒转移载体pfastbac<'tm>中，构建转移载体pfast-vsv-g，在vsv-g下游的多克隆位点插入cmv启动子驱动的编码pcv2 orf2蛋白的整个读码框，构建重组病毒ac-v-orf2。用相同的方式构建表达增强型绿荧光蛋白(egfp)的重组病毒ac-v-egfp。体外转导试验表明，构建的重组病毒均能高效转导哺乳动物细胞，报告基因的表达水平与杆状病毒的感染剂量成正相关，当感染复数越高，表达报告基因的细胞数越多。将重组病毒分别以不同的剂量(10<'10>pfu/ml， 10<'9>pfu/ml， 10<'8>pfu/ml) 肌肉注射免疫小鼠，试验结果表明，在首免后第三周，重组病毒ac-v-orf2 10<'10>pfu/ml 免疫组即可检测到较高水平的elisa抗体，加强免疫之后，ac-v-orf2 10<'10>pfu/ml 免疫组elisa平均抗体滴度达到1：7169，而平均中和抗体水平达到 1：16，显著的高于其它免疫组。细胞免疫水平表现出与体液免疫水平相似的趋势，ac-v-orf2 10<'10>pfu/ml 免疫组的细胞免疫水平显著高于其它免疫组，因此，不管是体液免疫水平还是细胞免疫水平，ac-v-orf210<'10>pfu/ml 免疫组表现出最佳的免疫效果，是一种具有良好发展前景的pcv2新型候选疫苗。

关 键 词： 猪圆环病毒 杆状病毒 亚单位疫苗 疫苗 免疫原性

分 类 号： [S858.28 S852.5]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]