导　　师： 王振中

学科专业： I0401

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 本文通过蛋白质组学技术，研究稻瘟菌(magnaporthe grisea)糖蛋白激发子csb Ⅰ诱导后水稻(oryza sativa)的蛋白质表达差异，拟从蛋白水平上分析稻瘟菌激发子诱导水稻的抗病性机理，探明水稻在蛋白质水平上对激发子处理的应激反应，最终为水稻抗性品种的选育提供参考。 从广东稻瘟病菌优势小种之一zc<,13>(菌株97-151a)中提取纯化了糖蛋白激发子，建立了适合于水稻叶片蛋白质组的研究技术体系。以co39为背景的抗稻瘟病近等基因系水稻为材料，在激发子处理后不同时间取样，经叶片总蛋白提取，双向电泳，图像分析，ltq-ms/ms质谱鉴定，对激发子诱导的水稻差异表达蛋白进行了鉴定和功能解析。 经离心、超滤膜(pm-10)超滤、sephacryl-100凝胶柱、deae—sepharose ff离子交换柱层析纯化从稻瘟菌中获得了糖蛋白激发子csb Ⅰ，经sds—page达电泳纯。 对基于双相电泳的水稻叶片蛋白质组研究技术体系进行的研究表明，适合于本研究的最佳条件为：(1)蛋白提取液引入硫脲、两性电解质载体和chaps；(2)三氯乙酸/丙酮沉淀蛋白；(3)等电聚焦条件：蛋白上样量130-150μg，聚焦时间vxhr值在35,000-40,000之间；(4)第二向sds-page的胶浓度10％和12％。 稻瘟菌激发子诱导后水稻的蛋白质差异表达结果表明： (1)以co39为背景的水稻抗稻瘟病近等基因品系为材料，与稻瘟菌97-151a组成完全非亲和性互作(c101a51)、高度非亲和性互作(c101lac)和亲和性互作(co39)，用激发子处理叶片后，在3、6、9、12、24、36和48h 7个时间点取样，经2-de分离，采用 imagemaster<'tm> 2d platinum5.0软件对2-de图谱进行分析，确定22个蛋白为水稻在激发子处理后在不同品系、不同时间被诱导差异表达的蛋白。 (2)品系内的激发子诱导蛋白分析。与对照相比，在激发子处理后的3、6和48h，3个品系都没有发现被诱导表达差异的蛋白；在9、12、24、和36h，激发子诱导co39品系的差异表达蛋白数目分别为10、21、6、1个；c101a51的分别为9、21、6、1个；c101lac的分别为9、21、6、1个。激发子诱导的蛋白包括被诱导新产生、表达上调和下调。同一被诱导蛋白在品系内的不同处理时间，其表达丰度不一，表明水稻被激发子诱导的差异表达蛋白具时间的动态性。 (3)品系间的激发子诱导蛋白分析。在同一时间处理时间，对不同水稻近等基因品系中的激发子诱导蛋白进行匹配，结果表明，在12，24和36h，3个品系间的差异蛋白点能相互的匹配，而在9h有1个蛋白只在激发子处理后的co39中被诱导表达；同时分析也发现，被诱导的蛋白的表达量在不同品系间存在差异。说明尽管不同的品系对激发子的诱导信号的反应程度不一，但是激发子诱导不同品系的水稻的防卫反应机制应该是相似的。 采用ltq-ms/ms鉴定了22个差异表达的蛋白，结果显示，在激发子诱导差异表达的蛋白中包括6种类型：ros反应自由基的清除类蛋白、信号传导类蛋白、植物防卫反应类蛋白、细胞凋亡类蛋白、基础代谢类蛋白和蛋白质的翻译和修饰类蛋白。这些差异表达的蛋白，共同参与激发子诱导的水稻的防卫反应，有助于初步去探明水稻获得抗病性机理。 ros反应自由基的清除类蛋白：与ros反应相关的mn-sod、cu/zn-sod和gst、cat‘分别在激发子处理后表达量明显上升和被诱导新产生，证明水稻在激发子诱导后产生了ros反应。 信号传导类蛋白：ndpk和推测的profilin在激发子处理后被诱导新表达，它们分别参与调控细胞内map kinases信号传导体系和ip<,3>信号传导体系，可以推断激发子诱导的防卫反应网络是多种信号途径的交叉组成。 病程相关蛋白：作为植物系统获得抗病性的基本特征之一的pr-10a和pr-5在激发子处理水稻后被诱导新产生，证明经激发子诱导后水稻获得了抗病性。 盐胁迫蛋白、细胞凋亡相关蛋白sumo和tctp在激发子处理后差异表达，说明它们与激发子的诱导抗性有关。 基础代谢类蛋白：包括推测的转酮醇酶、推测的果糖二磷酸醛缩酶i、推测的苹果酸盐脱氢酶、细胞质苹果酸脱氢酶、γ--羟丁酸脱氢酶类似蛋白和推测的酸性磷酸酶在激发子处理后表达发生改变，表明激发子的诱导抗性反应涉及糖、磷等基础代谢。 蛋白质的翻译和修饰类蛋白：推测的核糖体蛋白s5、推测的核糖体蛋白l12、翻译延长因子tu和推测的分子伴侣蛋白-21的前体受激发子的诱导后表达发生改变，说明激发子诱导的防卫反应需要这些蛋白辅助合成和修饰其它被诱导的蛋白。 ndpk、pr-10a和pr-5这3个与诱导抗病性紧密相关的蛋白的表达丰度在非亲和品系c101a51和c101lac中远比亲和品系c039的高，特别是pr-10a和pr-5在完全亲和互作的品系c101a51的表达丰度为c039的3倍以上，证明非亲和品系比亲和品系对激发子诱导的防卫反应信号反应更为迅速和强烈，诱导抗性强度在非亲和品系中比亲和品系的更大。

关 键 词： 水稻病害 稻瘟病菌 糖蛋白激发子 抗病诱导

分 类 号： [S435.111.41]

领　　域： [农业科学] [农业科学]