导　　师： 吴灶和;简纪常

学科专业： I0801

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 广东海洋大学

摘　　要： 本文研究了营养成分、培养时间、温度、酸碱度、盐度、edta、缺铁培养对溶藻弧菌hy9901株的生长、胞外产物(extracellular product,ecp)的分泌、胞外蛋白酶(extracelluar produc protease，ecpase)的活性、ecp的毒性、外膜蛋白(outermembrane protein,omp)的表达产生的影响。 研究发现： 溶藻弧菌的最佳生长条件：细菌接种于起始pn为7.2，含2％氯化钠的tsa固体培养基，28℃培养18小时，ecpase的活性以及ecp对动物的致死率均为最大。提示在该体外培养条件下，细菌的抗原性表达最大，可用作该菌全菌灭活疫苗生产的培养条件。 ecp的电泳图谱：细菌在不同培养条件下ecp的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)图谱相似但不完全一样。温度对溶藻弧菌ecp的图谱影响最大，表现为：15℃培养时主要的ecp的相对分子量为70kda，此条件下几乎观察不到62kad条带；20℃和28℃同时含有ecp70kda和62 kda，但蛋白含量不同，ecp70kda，在20℃时的表达量最大，28℃时ecp62 kda的蛋白浓度最高；细菌在37℃培养下无法观察到ecp70kda和62kd蛋白的表达。此外，培养时间对ecp的图谱也有影响。48h组和72h组均增加了97kd和74kd的表达量，72h组还增加了相对分子量为30kda、29kda、27kda和25kda条带的表达量。ecp主要蛋白对不同培养基、ph、盐度、edta的变化不很明显。 omp的电泳图谱：细菌在不同培养条件下mop的电泳图谱相似但不完全一样，但所有图谱均具有分子量为35kda的条带。温度对溶藻弧菌mop的图谱影响最大，表现为：45kda omp随着温度升高，其合成量增大，28℃时达最大值；而40kda和34kda omp则随着温度的升高而减弱。培养时间对omp的图谱也有影响，6h组的omp电泳图谱跟其它组相比缺少分子量为27kda的蛋白条带，但增大了25kda条带的表达量。此外，在缺铁培养下，相对分子量为108kda、91kda和82kda蛋白的表达量增加了。但是，omp主要蛋白对不同培养基、ph、盐度、edta的变化不很明显。 细菌ecp和omp的免疫原性：用免疫转印法(western blotting)测定细菌ecp和omp的免疫原性。结果显示细菌在不同培养条件下的ecp均具有62kda条带被兔抗溶藻弧菌血清所识别，而omp与兔抗溶藻弧菌血清的主要免疫反应带为45kda和35 kda。ecp62kda、omp45kda和omp35 kda对环境变化不敏感，提示这些蛋白具有重要功能，可作为亚单位疫苗生产的候选蛋白，它们的最佳体外表达条件与该菌的最佳生长条件相同。培养条件对ecp毒性的影响：取不同培养基培养的细菌胞外产物进行小鼠和红笛鲷的致死试验，结果发现：不同培养温度对ecp毒性的影响最大，在不同温度培养的细菌所提取的ecp对小鼠的致死试验中，20℃组和28℃组的死亡率均为100％，37℃组对小鼠只有致病性没有致死性。随培养温度升高所提ecp对红笛鲷的致死率先升高后下降，表现为：28℃组死亡率为100％，37℃组与15℃组死亡率则只有20％。 金属螯合剂对细菌的影响：联吡啶和edta对溶藻弧菌生长均有抑制作用。缺铁培养下，载铁体的产量随着培养基中fe螯合剂2，2’-联吡啶的浓度升高而升高；但胞外产物的酶活性却与联吡啶的浓度成负相关。 ecp 62kda的毒性：通过研究电泳纯化的ecp 62kda蛋白的酶活性和致死试验，证明ecp62kda具有很高的酶活性和毒性。

关 键 词： 溶藻弧菌 胞外产物 外膜蛋白 培养条件 免疫原性 红笛鲷

分 类 号： [S945.19 S942.5]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学]