导　　师： 林俊芳

学科专业： G1001

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 本文从纤溶酶高产菌株的选育入手，经过大量的筛选和选育，得到一株高产纤溶酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种(bacillus subtilis natto mbs04-6)，并对其益生特性进行分析、研究了其产纤溶酶培养基和产酶条件，构建了分批发酵动力学模型，对采用peg．磷酸盐双水相体系纯化纤溶酶条件进行了研究。 (1)从日本纳豆、图瓦人酸马奶和食堂废水中共分离得到329株芽孢杆菌，其中从103株芽孢杆菌发酵液检测到纤溶酶活性，对其中17株产酶活性较高的菌株进行鉴定，结果表明日本纳豆中分离的7株菌(bs01-1、bs01-2、bs01-5、bs01-7、bs01-8、bs01-9、bs01-11)、酸马奶中分离的btw-9和btw-11以及从食堂废水中分离的f13共10株确定为枯草芽孢杆菌(b．subtilis)，酸马奶来源的btw-6和btw-7为短小芽孢杆菌(b.pumilus)，其余来源于食堂废水的f21、f32、f36、f42和f46共5株芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(b．cereus)。对bs01-1和f46的16srdna进行pcr扩增测序，并在genebank进行blast分析进一步确证了该两株芽孢杆菌的分类地位。 (2)根据溶纤活性与蛋白酶活性的相关性，对纤溶酶产量较高的菌株bs01-1进行紫外诱变和正向筛选，得到一株突变株mbs04-6，其发酵液的纤溶酶活性明显提高，达到4179u/ml，比出发菌株产纤溶酶提高87％，且该菌株的遗传稳定性好。mbs04-6突变株与出发菌株bs01-1比较，两菌株特性有较大差异， mbs04-6生长速率明显高于出发菌株。mbs04-6突变株具有很强的耐受盐酸的能力，可耐受ph低至2.5的强酸性环境，说明该菌株可顺利通过胃到达小肠；但实验表明mbs04-6不耐受胆盐，在0.3％的胆盐浓度下即受到严重抑制，在小肠中生长可能受到抑制；对三种常见抗生素硫酸链霉素、壮观霉素和青霉素均不显示抗性，证明该菌株的安全性较高。 (3)发酵条件的单因素实验结果表明，温度、转速、ph、装液量4个因素对mbs04-6的菌体生长和纤溶酶积累的影响是一致的。但两者对发酵时间上的反应有所不同，即纤溶酶出现的峰值滞后于菌数增长，说明mbs04-6产纤溶酶可能是部分偶联型。采用正交实验设计确定mbs04-6的最佳摇瓶发酵条件为温度32℃、转速200r/min，ph7、装液量40ml、接种量3％、发酵时间48h。采用中心旋转组合设计确定mbs04-6的优化产酶培养基配方为玉米淀粉2.5％、酵母提取物0.4％、大豆提取物6％、k<,2>hpo<,4>0.1％、kh<,2>po<,4> 0.1％和mgso<,4> 0.02％。优化后的发酵条件下所得的纤溶酶活性为6015.7±458u/ml，比出发培养基和培养条件下发酵所得酶活4297.4±113u/ml，增产39.98％。 (4)在7升罐中上罐实验结果表明，搅拌转速和通气量对mbs04-6发酵产纤溶酶具有显著的影响，提高发酵罐转速和通气量，增加罐内溶氧有利于菌体的生长繁殖和代谢产纤溶酶，其产酶高峰期和菌体快速增长期均明显提前。mbs04-6 发酵液纤溶酶活性随菌体生物量的增加而增强，但滞后于菌体增长，在菌体生长的对数生长末期和稳定期，发酵液纤溶酶活性快速增强，证明mbs04-6产纤溶酶是生长部分偶联型。分别采用monod方程、luedeking-piret方程和imedeking-piret-like方程描述了菌体生长动力学模型、纤溶酶生成模型和底物消耗模型。所建立的三个动力学方程为： 这些动力学方程能较好的解释发酵过程中的底物利用和细胞生长规律，但菌体生长后期和纤溶酶产生的中后期，模型值与发酵数据有偏差，还需要进一步的研究加以修正。 (5)考察了peg-磷酸盐双水相体系萃取分离mbs04-6发酵液中纤溶酶的可行性。分别对peg分子量和浓度、对磷酸盐浓度、体系pn、载样量、nacl浓度和萃取温度等对纤溶酶在两相中分配行为的影响进行了考察。综合考虑各因素对纤溶酶回收率和纯化倍数的影响，选用peg400 20％(w/w)、k<,2>hpo<,4>-kh<,2>po<,4> 15％(w/w)组成的双水相体系，在ph8.4、萃取温度30℃、载样量20％的条件下萃取纤溶酶，结果表明其回收率(％r<,a>)达到89.19％，纯化倍数(p<,f>)为2.2。经实验室规模放大10倍后，体系对纤溶酶的纯化倍数为1.58，回收率为87.58％，说明采用该双水相体系从发酵液直接萃取纤溶酶是可行的。

关 键 词： 纤溶酶 高产菌株 诱变育种 发酵动力学

分 类 号： [TQ925]

领　　域： [轻工技术与工程] [化学工程]