导　　师： 彭新湘

学科专业： G1010

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 本文采用可调控反义rna技术和超表达技术来调控水稻glo活性，以期从分子水平深入探讨glo的生理功能及其作用机理，主要结果如下： 1．超表达载体的构建及其转化。通过rt-pcr从水稻cdna中扩增得到glo的完整序列。经生物信息学分析，可知在水稻基因组中共有5个glo的相似序列，分别在第三、四和第七染色体上。构建诱导型和组成型超表达载体并转化水稻，经初步pcr和southern杂交检测，确认已经得到超表达转基因植株，在组成型glo超表达水稻株系中，其glo活性可提高70％左右。 2．反义glo水稻的诱导表达分析。利用已获得的反义glo水稻，对其诱导表达活性进行系统分析。在获得的46个独立株系中，筛选到2个株系其glo活性经诱导处理后显著降低。诱导剂浓度在0.2-1μm之间glo活性下调速度最快，超过1μm后glo活性下调速度减慢，5μm时达到最佳效果：以5μm的诱导剂浓度处理6天，其glo活性可以下调约60％，处理至9天，其活性可以下调90％以上，处理12天后已经几乎检测不到glo活性，而诱导剂对野生型植株中的glo活性没有影响。在较强光照下，经诱导处理12天后，转基因植株的生长受到强烈抑制，植株矮小，叶片微黄。 3．glo活性下调对水稻光呼吸的影响。经诱导处理后，以低氧抑制法和无co<,2>法分别测定水稻光呼吸，发现低氧抑制法所测结果野生型与转基因植株没有明显差异。而无co<,2>法测定结果显示：光呼吸速率随着glo活性下调比例增大而不断降低。乙醇酸大量积累而乙醛酸含量却与野生型没有差异，提示很可能有别的代谢机理参入提供乙醛酸。此外，northern杂交分析表明，酶活性抑制90％以上的反义水稻中glomrna表达已很低，但其下游基因sgat、gdc-h和hpr的表达却没有受到影响，而icl表达量的提高说明icl很可能通过裂解异柠檬酸生成乙醛酸参入到光呼吸途径；甘氨酸和丝氨酸的含量反而有提高趋势，谷氨酰胺大量积累而谷氨酸含量降低，可能glo活性的下调抑制了谷氨酰胺的代谢。采用dab染色法分析h<,2>o<,2>含量的结果表明，随着glo活性的降低，转基因植株体内的h<,2>o<,2>含量大幅降低。 4．glo活硅下调对水稻光合作用的影响。随着glo活性下调比例增大，水稻光合速率也随之下降，二者之间呈极显著线性关系，且这种线性关系的出现的迟早与光强有关，光强越高，线性关系出现越早。800μmol m<'-2>s<'-1>光强下比在350μmol m<'-2> s<'-1>光强下提前3天左右出现线性关系。glo下调对叶绿素荧光的影响具有“阀值”效应，只有当glo下调超过60％左右时，植株的叶绿素荧光才开始急剧下降，其中fv/fm、ψpsⅡ和qp下降而f<,0>和npq上升，表明此时已产生明显的光抑制。northern杂交结果表明，说明随着glo的下调，rubisco大亚基基因rbcl和谷氨酸合成酶基因fd-gogat的表达逐步受到抑制。由此看来，光合速率的降低很可能是由于rbcl受到抑制引起的，而fd-gogat的抑制可能是引起谷氨酰胺积累和谷氨酸含量降低的原因。高浓度的co<,2>可以基本消除转基因植株与野生型植株之间的表型差异。在高co<,2>条件下，野生型植株中glo活性与正常空气中相当；反义植株中glo的活性下调对光合速率和叶绿素荧光已无明显影响。在高浓度co<,2>条件下，反义水稻植株中仍有大量乙醇酸积累，而乙醛酸含量没有明显变化，表明光呼吸可能并不是水稻乙醇酸和乙醛酸的唯一来源。 5．glo活性下调对水稻草酸积累影响。反义glo水稻诱导处理6天和12天时，分别取样测定其glo活性和草酸含量，发现诱导6天时，glo活性已下调约60％，诱导处理12天时，活性已下调90％以上，此时已基本检测不到glo的表达，但其草酸含量始终没有明显差异，说明水稻中的草酸的积累调控并不依赖于glo表达。 综上所述，本研究实现了对水稻glo的诱导调控，生理功能分析表明可能有新的代谢参与光呼吸途径，而glo在调控水稻的光合作用以及抵御光抑制方面具有重要的作用。

关 键 词： 水稻 乙醇酸氧化酶 分子调控 光合作用

分 类 号： [S511.01 Q946.5]

领　　域： [农业科学] [生物学]