导　　师： 杨传平

学科专业： I0701

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 东北林业大学

摘　　要： 我国土壤重金属污染问题不断恶化，亟待解决。深入研究植物的耐重金属机理，克隆相关基因并利用基因工程技术提高植物对重金属的抗性，是净化污染土壤的一条有效途径。金属硫蛋白(metallothioncin，mt)是一类广泛存在于生物中的低分子量，富含半胱氨酸可结合重金属的蛋白质，在土壤重金属污染的治理中越来越引起人们的重视。 应用生物信息学技术从柽柳和星星草cdna文库中分别克隆了柽柳和星星草的 mt基因，对该基因编码的mt进行了蛋白质家族、疏水性、信号肽、等电点及分子量的预测，并选取了几种植物的 mt 基因氨基酸序列进行了多序列比对分析及分子进化树绘制，结果表明克隆的柽柳和星星草mt基因符合植物mt基因所具有的典型特征。 将从柽柳中克隆到的mt基因构建到载体prokⅡ上，通过农杆菌介导的叶盘法对烟草进行遗传转化，共获得75株卡那霉素抗性苗，转化率达到78％。选取10株长势良好的转基因烟草进行分析，pcr检测结果均为阳性；对其中6个转基因株系进行pcr-southern杂交和northern杂交，结果均为阳性，证明外源基因已整合到烟草基因组中并得到表达。 将在柽柳和星星草中克隆到的mt基因分别连接到载体prokⅡ上，构建了柽柳和星星草mt基因双价植物表达载体，对烟草进行遗传转化，共获得83株卡那霉素抗性苗，转化率达到75％。选取10株长势良好的转基因烟草进行分析，pcr检测结果均为阳性：对其中7个转基因株系分别用柽柳和星星草mt基因标记的探针进行pcr-southern 杂交，结果均为阳性；再从中选取5个转基因株系进行northern杂交，结果均为阳性，证明外源基因已整合到烟草基因组中并得到表达。 对非转基因对照烟草、转柽柳mt基因烟草和转柽柳、星星草mt基因烟草t<,0>代组培苗进行了重金属cd和cu胁迫试验，测定并分析了各转基因烟草及非转基因对照烟草胁迫后的生根率、增重和株高变化。结果显示，t<,0>代转基因烟草在不同浓度cdcl<,2>和cuso<,4>胁迫条件下，生根率、增重和株高均高于非转基因对照烟草。在cdcl<,2>胁迫下，非转基因对照烟草能在100μmol·l<'-1>cdcl<,2>浓度下生长，转柽柳mt基因烟草能在200μmol·l<'-1>cdcl<,2>浓度下生长，而转柽柳、星星草mt基因烟草能在300μmol·l<'-1>cdcl<,2>浓度下生长。在cuso<,4>胁迫下，在75 μmol·l<'-1>cuso<,4>浓度下，三者均能正常生长；在150μmol·l<'-1>cuso<,4>浓度下，对照烟草不能生长，转柽柳mt基因烟草生长缓慢，植株矮小，转柽柳、星星草mt基因烟草大部分能正常生长；在225μmol·l<'-1>cuso<,4>浓度下，转柽柳、星星草mt基因烟草不能生长，但生长量有所增加。试验表明，mt基因的导入提高了t<,0>代转基因烟草对cd和cu的耐受力，其中转基因烟草对cd的抗性要高于对cu的抗性，并且转双价mt基因比转单价mt基因更能提高转基因烟草对重金属的耐受力。 将t<,0>代自交得到的转基因烟草种子播种于含100 mg/lkan的ms培养基上培养20 d后，对8个转基因株系的绿白苗之比进行统计，结果表明转柽柳mt基因烟草t<,1>-5、t<,1>-8和转柽柳、星星草mt基因烟草t<,1>′-2、t<,1>′-3的绿色苗与白化苗分离规律基本符合(2<'2>-1):1；转柽柳mt因烟草t<,1>-6和转柽柳、星星草mt基因烟草t<,1>′-9株系的绿色苗与白化苗分离规律基本符合(2<'4>-1):1。 对8个转基因株系卡那霉素抗性植株进行pcr检测，结果均为阳性，初步证明了mt基因仍整合在烟草子一代基因组中。 对8个转基因烟草株系子一代(t<,1>)进行了cd胁迫试验，测定并分析了cdcl<,2>胁迫下转基因烟草生长量的变化。结果显示，转基因烟草t<,1>代组培苗在根长、根数、苗增重、叶片数方面均高于非转基因对照烟草。转柽柳mt基因烟草能够在cdcl<,2>浓度为100μmol-l<'-1>培养基上生长良好，平均增重是非转基因对照的3.07倍，平均根长是非转基因对照的1.96倍；转柽柳、星星草mt基因烟草能够在cdcl<,2>浓度为200μmol-l<'-1>培养基上生长，平均增重是非转基因对照的3.85倍，平均根长是非转基因对照的2.74倍；而非转基因对照烟草在cdcl<,2>浓度为100μmol-l<'-1>时就表现为生长缓慢，根系受到明显抑制。试验表明转双价mt基因烟草比转单价mt基因烟草具有更强的cd抗性。证明了外源mt基因可以在烟草子一代中遗传，该基因的表达提高了烟草对cd胁迫的耐受能力。

关 键 词： 柽柳 星星草 金属硫蛋白 生物学功能 土壤重金属污染 烟草 遗传转化 遗传育种

分 类 号： [S793.504 S572.01 X53]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [农业科学] [环境科学与工程]