导　　师： 谈家桢;唐克轩

学科专业： G1007

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 复旦大学

摘　　要： 植物中维生素c(l-ascorbic acid，asa)不仅对于植物自身的抗氧化系统、光合保护以及调节生长发育等具有非常重要的生理功能，更为人类提供了丰富而方便的维生素c源。通过基因工程技术提高植物asa含量，改良植物营养品质和抗性是分子育种新的发展方向之一。虽然植物asa的生物合成途径已经比较清楚，并从不同物种中克隆得到相关关键酶基因，但是针对不同基因过量表达后对asa含量的影响以及不同基因合理组合进行共转化的研究不多，迄今尚未获得对该途径进行遗传改造的最佳策略。本研究以模式植物拟南芥为实验对象，通过rt-pcr分别从拟蓝芥和花椰菜中克隆得到asa合成、降解和还原途径中的一系列关键酶基因并构建植物表达载体，采用浸花法转化拟南芥，考察不同限速酶基因在该途径中的作用以及增强(抑制)表达对asa含量和表型的影响。 过量表达gdpmppase植株中gdpmppase的直接催化产物gdp-d-甘露糖的含量提高了2.1-2.5倍。asa的含量为 3.79 μmol/g fw，是wt的1.53倍，ck的1.71倍；过量表达galppase植株中asa的含量为2.99 μmol/gfw，是wt的1.21倍，ck的1.35倍。单基因转化合成途径关键酶基因，能够在一定程度上促进asa的生成，但是提升幅度有限。相对于酶活指标而言，前体化合物是否充足显得更为重要： 通过转化rnai抑制表达载体，下调asa降解途径中的关键酶基因．ao的表达，转基因植株叶片和胞外体中ao的酶活显著降低，长势受到明显抑制。叶片中总asa含量，包括asa和其氧化产物dha的比例都没有明显变化，但是胞外体中总asa的含量最高达到1.02μmol/g fw，显著高于对照组。同时提高了asa/dha的比值，说明抑制表达ao后有效地减少了胞外体中asa的氧化，使得更多的asa保持在还原状态； 过量表达内源dhar可以有效激活asa再生途径，在dha降解前将其还原为asa。结果显示拟南芥叶片中asa的含量提高了4倍。同时提高了还原型(asa)和氧化型(dha)的比例以及谷胱甘肽的含量； 通过构建亚细胞定位载体使内源galdh在植物线粒体过量表达，可以显著提高线粒体内该酶的活性。但是叶片中asa的含量并没有显著提高。离体饲喂外源asa的直接前体l-半乳糖-γ-内酯(l-gal)可以同时提高对照组和转基因组中asa的含量。对于植物来说，高浓度的l-gal是促进．asa合成的必要前提。仅仅超表达galdh使l-galdh过量，不能为跨膜进入线粒体内合成l-gall提供充足的l一半乳糖(l-gal)，形成新的瓶颈；由于植物合成asa是一个有氧代谢过程，通过转化来源于原核生物透明颤菌的血红蛋白基因vhb可以有效改善植物在合成asa的过程中对氧的利用效率，转基因组asa的含量比野生型提高近4倍，同时增强了对多种非生物胁迫的抗性。提示可以利用来源于微生物的丰富的基因资源促进能量代谢进而增加 asa的产量； 采用cre/lox系统成功构建了带有不同基因组合的一系列中间载体和多价载体，拟通过转基因研究对asa途径中的多个基因作一系列的组合干涉，考察各基因在代谢途径的上下游关系和多基因共转化的效果，调控完整的代谢途径，促进代谢流向asa流动。 本课题着眼于植物asa的代谢网络及其调控机制，通过以上6个方面的系统研究，对代谢途径中关键基因和代谢工程技术进行深入探讨，建立了植物asa代谢途径优化与改造的新策略，为克服合成途径中的限速步骤提供了一系列人工修饰突变体，为找到一个真正有效的提高植物asa含量的遗传改造策略奠定了基础。

关 键 词： 拟南芥 维生素 植物代谢工程 限速酶基因 转基因工程 亚细胞定位 多基因组装载体

分 类 号： [Q945.1 Q943.2]

领　　域： [生物学] [生物学]