导　　师： 束文圣

学科专业： H3001

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 中山大学

摘　　要： 宝山堇菜(violabaoshanensis)是在中国南方发现的一种新的cd超富集植物。从宝山堇菜中克隆cd耐性相关基因的目的在于：(1)揭示宝山堇菜对cd解毒和转运的分子机制；(2)提供更多候选基因用于改良植物的cd耐性和富集性能。本论文研究工作主要包括：(1)调查宝山堇菜在不同生境下的重金属积累特征；(2)采用抑制消减杂交技术调查cd处理(300μmcd，48h)宝山堇菜根的转录剖面(profile)，并对分离基因进行表达分析；(3)对部分基因进行全长cdna扩增和原核表达分析；(4)对七个大环寡肽前体基因进行表达模式分析和酵母表达分析。取得的主要研究结果如下： 1.野外调查发现，四个样点的宝山堇菜地上部的cd含量均高于100mg/kg，从样点1到样点4依次为826，230，32l和167mg/kg。样点3宝山堇菜pb平均含量高于1000mg/kg，地上部和地下部的含量分别为2041和1305mg/kg。宝山堇菜地上部和根部的重金属含量与土壤总量显著相关(p<0.05，部分为p<0.01)。宝山堇菜cd积累量与dtpa提取态cd和土壤总cd相关性系数分别为0.89(p<0.01)和0.68(p<0.01)。 2.溶液培养实验表明，在30μmcd(12d)处理条件下，宝山堇菜根部和地上部干重中的cd积累量分别为27和352mg/kg；在300μmcd(12d)处理条件下，宝山堇菜根部和地下部干重中的cd积累量分别为602和2595mg/kg，说明宝山堇菜能超富集cd。100μmcd(40d)处理对宝山堇菜的生长没有明显的影响，说明宝山堇菜具有较强的cd耐受能力。 3.从300μmcd处理宝山堇菜根中鉴定了43个表达序列标签(est)。根据同源物的功能可将分离基因归为6类：抗氧化酶(6个est)、蛋白代谢(9个est)、信号转导(5个est)、植物防卫肽(5个est)、其它代谢(5个est)以及功能未知蛋白(12个est)。大部分分离基因为组成型表达，再次证实cd超富集植物的cd耐性主要依赖于植物的组成型防卫。 4.利用smart-race技术对12个est的cdna末端进行了扩增，3’-race延伸cdna末端的长度在97-550bp之间，5’-race则在37-1192bp之间。通过装配序列的阅读框分析以及编码蛋白的同源比对分析，鉴定了9个具有完全编码区的序列。其中5个序列编码不同的大环寡肽前体蛋白(cyclotideprecursor，cp)，分别命名为vbcp1、vbcp2、vbcp3、vbcp4和vbcp5。另外4个序列分别编码小分子胁迫蛋白、gdp甘露糖焦磷酸化酶、翻译起始因子suil和一个半胱氨酸丰富的小蛋白，依次命名为vbsp1、vbgmapase、vbsuil和vb40。 5.将5个vbcp基因(vbcp1-vbcp5)和vbgmpase转化至大肠杆菌jm109中，vbcp1、vbcp3、vbcp4、vbcp5和vbgmpase的转化子表现出较对照(pqe40转化子)更强的cd耐性。此外，重组蛋白vbcp4和vbgmpase在大肠杆菌m15[prep4]中也获得了稳定的高表达。 6.分析5个vbcp基因(vbcp1-vbcp5)在宝山堇菜中的表达，发现这些基因在对照和cd处理根中高表达，在叶中的表达相对较弱。电泳分析发现，在vbcp5的叶rt-pcr产物中，出现两组较vbcp5更长的dna带。这两组dna带被进一步鉴定为两个新的cp基因vbcp6和vbcp7，vbcp6和vbcp7主要在叶中表达，在根中未检测到它们的表达。 7.本研究定义大环寡肽的第1个cys到第6个cys之间的序列为六半胱氨酸框(sixcysteineframe，scf)。7个vbcp基因(vbcp1-vbcp7)编码的vbcp蛋白分别含有一个scf(vbcp1-vbcp5)、两个scf(vbcp6)或三个scf(vbcp7)：7个vbcp蛋白的scf长度包括4种类型：22aa(vbcp6和vbcp7)、24aa(vbcp1-vbcp3)、25aa(vbcp4)和28aa(vbcp5)。将genbank蛋白数据库中的66个大环寡肽和26个cp进行scf分析发现，vbcp4和vbcp5分别是仅有的含25-aa-scf和28-aa-scf的cp蛋白，vbcp6是仅有的含两个22-aa-scf的cp蛋白，因而vbcp4、vbcp5和vbcp6代表了cp蛋白的三种新类型。大环寡肽和cp的scf长度很少高于25aa，因而含28-aa-scf的vbcp5也代表了一种稀有的cp类型。 8.将七个vbcp基因(vbcp1-vbcp7)转至酿酒酵母yl36中，分析不同转化子的重金属耐性。vbcp2、vbcp4、vbcp6和vbcp7转化子的cu耐性高于其它转化子，vbcp4、vbcp6和vbcp7转化子的zn和cd耐性也轻微高于对照载体转化子。由于已有大环寡肽存在金属束缚位点的报道，结合本研究的实验结果得出结论：从宝山堇菜中鉴定的cp基因与植物重金属耐性有关，它们的编码大环寡肽可能代表一类新的金属束缚蛋白。

关 键 词： 宝山堇菜 镉耐性 基因克隆 大环寡肽 前体基因 分子机制

分 类 号： [Q943.2]

领　　域： [生物学]