导　　师： 林胜祥

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 中国科学院上海生命科学研究院

摘　　要： 本文包括两个部分： 第一部分辛纳毒蛋白的提纯，结晶以及结构分析辛纳毒蛋白是从香樟树种子中提取的一种Ⅱ型核糖体失活蛋白(rip)。它的a-chain是一种n-糖苷酶(rrna n-糖苷酶)，能专一地切去核糖体大亚基28s rrna的sarcin/ricin结构中的一个腺嘌呤，从而阻抑延伸因子与核糖体的结合，导致核糖体不能进行蛋白质合成。与蓖麻子毒蛋白一样，辛纳毒蛋白也是一种在种子中高含量的Ⅱ型rip，但与高毒性的蓖麻毒蛋白不同，完整的辛纳毒蛋白是低毒性，尽管它们氨基酸序列的同源性很高。我们通过改变提纯的方法，利用fplc不仅缩短了提纯目的蛋白所用时间，而且提高了最终蛋白的纯度，然后经过结晶条件的筛选，得到了蛋白晶体。晶体经过x-ray衍射分析，收集了衍射数据。数据经过处理后，以蓖麻子毒蛋白为起始模型，采用分子置换，最终在2.95 a确定其结构，结构的rfactor是25.6％，rfree是29.7％。并对其结构跟蓖麻子毒蛋白和相思豆毒蛋白的结构进行了比较分析。与蓖麻子毒蛋白以及相思豆毒蛋白等其它的Ⅱ型rip相比，在ab链之间相互作用上存在比较大的差别；我们还发现了它们在一个可能是核糖体rna结合位点上有着较大差别；并且在辛纳毒蛋白晶体结构的活性中心部位发现了一个的非共价结合的腺嘌呤。值得注意的是，在纯化与结晶的过程中没有任何腺嘌呤以及其衍生物都被添加，因此该腺嘌呤很可能是一个酶促反应后的产物。 第二部分 lcn6蛋白以及其se-met衍生物的表达，包涵体纯化，复性以及结晶。lcn6蛋白是lipocalin家族中新发现的一个蛋白。该家族的蛋白在高等动物中普遍存在，且种族间序列的同源性比较小。而lcn6蛋白与lipocalin家族的其它蛋白相比，一级结构的同源性也较小，但与已被证明有重要功能的lcn5与lcn8的同源性比较高，后两者最近已有证据显示它们跟精子的成熟有关。免疫荧光印迹表明lcn6主要集中表达在精子的头部与尾部。目前的证据表明，lcn6蛋白很可能与某个蛋白结合，以复合物的形式，参与了精子成熟的过程。我们实验室在大肠杆菌中表达了该蛋白，发现该蛋白表达为包涵体。我们系统研究了该蛋白包涵体纯化．变性以及复性的方法，并经过结晶条件的筛选，成功地得到了蛋白晶体，并在同步辐射中心收集到了数据。在结晶条件的筛选过程中，我们根据蛋白的可结晶性原理，设计了理性筛选结晶条件的方法，迅速地得到并优化了蛋白晶体。并且将纯化，复性以及结晶条件筛选的方法应用在lcn6的硒代衍生物上，也成功地纯化、复性了该蛋白，并且在相似的结晶条件下得到了晶体，同样在同步辐射中心成功收到完整的数据。目前结构用sad解决了相位，结构在分辨率为1.90 a确定下来，结构分析正在进行当中。

关 键 词： 辛纳毒蛋白 蛋白质结构 蛋白提纯 蛋白表达

分 类 号： [Q516 Q503]

领　　域： [生物学] [生物学]