导　　师： 杨琳

学科专业： I0502

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 为了获得具有降解纤维素能力的基因工程改造乳酸菌，进而解决瘤胃纤维降解菌耐酸性差的问题，本研究利用现代分子生物学技术对康宁木霉as3.2774纤维素酶cbhⅡ基因进行了克隆与表达。 本试验包括三部分：(1) 康宁木霉as3.2774菌种的恢复培养与诱导培养。通过马铃薯琼脂培养基(pda)对真空冷冻干燥菌种进行平板活化，28℃恒温培养5天。之后对活化好的菌株用mendels培养基，200转/分，30℃诱导培养4天。4℃，4000转/分，10分钟，离心收集菌体，-70℃保存。(2)康宁木霉as3.2774 cbhⅡ基因的克隆与测序。根据genebank已发表的纤维素酶cbhⅡ基因序列(dq504304)，利用premier5.0软件设计并合成了一对引物，通过反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)技术，从康宁木霉as3.2774的总rna中扩增cbhⅡ全长基因，琼脂糖凝胶回收纯化目的基因。通过t4dna连接酶将其直接连于克隆载体pmdl8-t simple，构建重组质粒pmd18-t-cbhⅡ，再转化至克隆宿主菌dh5a。利用蓝白斑筛选阳性克隆，然后提质粒、酶切、pcr鉴定、序列测定并经dnaman分析，证明重组质粒pmd18-t-gbhⅡ中是否含有cbhⅡ基因。(3)康宁木霉as3.2774 cbhⅡ基因的表达与检测。利用smaⅠ和sphⅠ对重组质粒pmd18-t-cbhⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase，thya)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pw425t进行双酶切反应，并将纯化的cbhⅡ基因亚克隆至表达载体pw425t中，构建出可以在乳酸菌和大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pw425t-cbhⅡ。将pw425t-cbhⅡ转化至thya基因缺陷性大肠杆菌e.coilx13中，利用生长功能弥补筛选阳性克隆并鉴定，将阳性克隆pw425t-cbhⅡ在ex13进行表达，通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析其表达情况。 试验结果：(1)康宁木霉as3.2774，经过5天的pda恢复培养，菌体生长旺盛，菌丝较长，分枝较多，能形成大

关 键 词： 康宁木霉 纤维素酶 瘤胃纤维降解菌 耐酸性 基因 基因克隆 基因表达 反刍动物

领　　域： [农业科学] [农业科学] [农业科学] [生物学]