导　　师： 陈克平

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 江苏大学

摘　　要： 杆状病毒(baculovirus)是已知昆虫病毒中的类群最大、发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。近年来，杆状病毒在杆状病毒表达系统、重组杆状病毒杀虫剂、杆状病毒基因治疗载体和杆状病毒表面展示系统等方面得到了广泛的运用。 截止2006年1月，已有29种昆虫杆状病毒的基因组被完全测序。目前已鉴定的29种杆状病毒中，有30多个基因在所有的杆状病毒中都相当的保守，称为核心基因(core genes)。还有相当一部分属于种、属特异性基因。一般认为，种、属特异性基因与寄主间的相互关系有关。本论文选择了家蚕核型多角体病毒(bombyx mori nucleopolyhedrovirus，bmnpv)bm35基因为研究对象，bm35基因是鳞翅目杆状病毒i型所特有的一个基因，属于种特有的基因。目前尚开展研究。研究该基因为进一步解析病毒和寄主相互关系奠定基础。本论文的主要结论如下： 1.bmnpv bin35位于 bmnpv基因组t3株的31903bp-32298bp处，编码区全长396bp，预测分子量为15kda。蛋白质序列分析显示具有一个典型的锌指结构(78-119aa处c3hc4型)和一些重要的基序。氨基酸序列同源性比较发现，bm35同源物存在于所测序的鳞翅目npvi型杆状病毒中，不存在于颗粒体病毒和其他非鳞翅目昆虫杆状病毒中。这表明，bm35同源蛋白可能是鳞翅目npv特有的种、属特异性蛋白。bm35与npvi型acmnpv orf44的同源性高达98％，与其它七种杆状病毒同源性亦非常高。 2.设计特异性引物，通过pcr扩增bm35全长基因，采用pet-30a载体在大肠杆菌中进行了融合表达。通过对bm35基因在大肠杆菌中的融合表达发现bm35蛋白在大肠杆菌系统中能够良好地表达，表达的融合蛋白分子量约为20.5kd，正好是15.0kda的bm35与5.5kda的his之和。western blotting进一步证实了pet30a-bm35在大肠杆菌bl21中表达的重组蛋白确实为his-bm35融合蛋白。 3.在昆虫细胞和家蚕蛹中成功地表达了融合egfp的bm35蛋白。通过观察到绿色荧光判断bm35得到了正确表达。通过bmnpv的bac-to-bac系统外源基因在家蚕细胞和蛹中的快速表达，证明bmnpv/bac-to-bac是一个快速表达系统。 4.利用red重组系统在大肠杆菌中成功地对bmnpv的bm35基因进行了快速定点敲除。并将bmnpv/bac-to-bac系统和red重组系统结合在一起，对敲除了bm35基因的bmnpv进行了拯救。分别构建了野生型病毒vbm35-wt，bm35基因缺失病毒vbm35-null和bm35基因拯救病毒vbm35-repair。荧光观察显示三种病毒在感染细胞后都有荧光，说明敲除bm35基因对病毒的复制影响甚微。初步研究了该基因的生物学功能。

关 键 词： 核型多角体病毒 家蚕 杆状病毒 昆虫病毒

分 类 号： [S881]

领　　域： [农业科学] [农业科学]