导　　师： 马文丽

学科专业： G1010

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 生物体在正常生命活动的代谢中会产生活性氧分子，这些活性氧是机体老化和损伤的重要原因之一。生物机体内，各种抗氧化酶类和抗氧化物构成了一个完善的活性氧清除体系。故正常生理条件下，机体环境中的活性氧处于动态平衡状态。但是在病理状态下或逆境应激条件下，机体抗氧化防御系统无法完全有效地抵御或修复氧化作用带来的损伤，可能导致机体内活性氧代谢失衡，活性氧积累而引发氧化损伤，进而引发一些疾病，如关节炎、动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症等。因此，摄取一些外源抗氧化物对维持体内活性氧代谢的平衡大有裨益。但由于许多人工化学合成的抗氧化物存在安全性问题，所以具有抗氧化活性的天然生物制品就越来越受到人们的青睐。超氧化物歧化酶（sod）是生物体内一种十分重要的防止氧化损伤的酶类，是内环境中超氧化物阴离子的清除剂。它能使线粒体有氧代谢产物：o2-歧化为o2和h2o2，从而清除o2-对生物体的毒性。自1969年首次被mccord和fridovich从牛红细胞中发现和分离提取以来，由于sod在抗氧化、抗肿瘤、抗衰老以及对抗细胞凋亡等方面所具有的重要作用，使得其在医药、食品、保健品、化妆品等行业中具有广阔的应用前景。随着大众对sod认识的不断深入，对sod相关产品的需求量也越来越大。目前，sod大多是从天然动植物中提取，但是，由于天然原料产物含量极微且提取工艺复杂等原因导致制成品纯度低，产量少，价格昂贵，将其应用于实际存在的问题较多。因此，通过基因工程重组技术生产sod酶蛋白是解决推广应用问题的有效途径。 乳酸菌是具有很高经济价值的一类益生菌，乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，增加食品保藏期和附加值，而且具有特殊生理活性和微生态功能。研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，具有降低血清胆固醇、抗肿瘤、抗衰老作用。近年来，国内外学者对乳酸菌的抗癌、抗突变活性研究的较多，但对乳酸菌抗氧化活性研究报道的较少。sod酶蛋白是乳酸菌抗氧化作用的最重要的保护酶，关于乳酸菌sod基因在大肠杆菌中的表达研究国内尚未见报道。本研究通过克隆乳酸菌sod基因并在大肠杆菌中进行表达，并对所克隆的sod基因进行序列分析，为后续的乳酸菌抗氧化活性的进一步研究及使用基因工程方法大批量生产sod奠定基础。 实验研究分为两个部分： 1、sod基因重组克隆载体的构建及序列分析。 方法： 本研究以乳酸乳球菌基因组dna为模板，以sod基因的特异性引物进行pcr扩增，获得sod基因。将该目的基因片段进行胶回收纯化后，与pgm-t载体进行连接，获得的重组质粒经酶切、pcr鉴定及测序，得到的序列利用在线分析软件进行分析。利用生物软件protparam对所克隆的蛋白质进行物理和化学变量分析；利用在线分析软件protscale、netphos、sopma、hnn对其一、二级结构进行分析。并利用在线分析软件blastx、biastp在ncbi数据库中进行同源性搜索。选取与乳酸菌sod氨基酸同源性较高的12种细菌sod氨基酸序列，用clustalx1．8程序进行多序列比对，并用mega4构建系统进化树。 结果： 重组质粒pgm-t-sod经bamhⅠ、xhoⅠ双酶切和pcr扩增均获得621bp的基因片段，证明成功构建了含有sod基因的重组克隆质粒。序列分析，推测出该基因编码的蛋白质是由206个氨基酸组成，分子量为23kda，等电点为4．96。疏水性分析表明sod是易溶、亲水性强的蛋白。磷酸化位点分析表明有3个ser，3个thr，5个tyr，可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。二级结构分析表明该蛋白氨基酸序列主要以α-螺旋为主。blastx分析结果表明克隆的sod基因与genebank登录的乳酸菌mn-sod一致性为99．9％，blastp分析发现克隆的sod酶蛋白氨基酸序列与genebank登录的乳酸菌mn-sod一致性为99％。预测的氨基酸序列中也发现了mn-sod特征性氨基酸，推测所克隆的sod为mn-sod。所克隆的sod基因氨基酸序列与其它12种细菌已知的该酶氨基酸序列进行多序列比对，结果显示，各种物种sod氨基酸序列具有较高的保守性，其中与金属离子配体相结合的活性中心位点（his-27，his-82，asp-168和his-172）是保守的，与其它文献一致，并发现了mn-sod与fe-sod相区分的“特征”性氨基酸：gly77、gly78、phe85、gly153、asp154，特别是与金属结合结构域的氨基酸区段dvwehayyl在这些不同的物种中是完全相同的。 2、sod基因原核重组表达载体的构建和在大肠杆菌中的表达。 方法： 将构建的pgm-t-sod克隆载体进行bamhⅠ和xhoⅠ双酶切，得到的产物经纯化与回收后，与原核表达载体pgex-6p-1相连接，成功构建pgex-6p-1-sod表达载体后，转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中获得重组菌株，将该重组菌在iptg的诱导下进行表达，用sds-page分析表达情况，并对表达条件进行了优化。 结果： 重组质粒pgex-6p-1-sod经bamhⅠ、xhoⅠ双酶切及pcr扩增均得到621bp的基因片段，证明成功构建了含有sod基因的原核表达载体。iptg诱导sod的表达分析：sds-page电泳分析表明，pgex-6p-1-sod重组菌经1．0mmol/liptg诱导4h，经sds-page电泳分析获得了一条表达条带，分子量约为49kda。不同iptg诱导浓度下sod融合蛋白的表达分析：iptg诱导浓度分别为0．4、0．6、0．8、1．0、1．5mmol/l时，重组质粒pgex-6p-1-sod在大肠杆菌bl21均获得了表达，以iptg浓度为0．8mmol/l诱导后表达量最高。不同诱导时间sod融合蛋白的表达分析：诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、8h时，重组质粒pgex-6p-1-sod在大肠杆菌bl21中均获得了表达，以诱导后5h表达量最高。 结论： 本研究成功克隆了乳酸菌sod基因并进行了序列分析，在大肠杆菌bl21中获得了表达。

关 键 词： 乳酸菌 超氧化物歧化酶 基因克隆 序列分析 原核表达

分 类 号： [Q933]

领　　域： [生物学]