导　　师： 吴金英

学科专业： G1004

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 中山大学

摘　　要： 肿瘤坏死因子（tnfα）是一种多效应的前炎症细胞因子，由巨噬细胞、单核细胞、多形核白细胞、肥大细胞及光滑肌细胞等多种细胞产生，在不影响正常细胞的前提下，于体内外均能杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞的增殖；参与和调控机体的免疫应答，上调其他炎症细胞因子的表达，增强包括吞噬、化学趋化、反应性氮氧物质的产生等一系列细胞学反应。 本文利用同源克隆和race方法从健康斜带石斑鱼头肾组织中克隆得到了斜带石斑鱼tnfα全长cdna序列和基因序列。斜带石斑鱼tnfα的cdna序列全长为1377bp，含有一个762bp的开放阅读框，编码253个氨基酸的蛋白。经生物信息学分析，斜带石斑鱼tnfα是一种跨膜蛋白，具有潜在的蛋白酶切位点及对其三级结构形成必需的2个半胱氨酸，也具有tnf家族的标签序列及5个炎症细胞因子不稳定基序attta；进化树构建结果表明：斜带石斑鱼tnfα与其他鱼类tnfα占据进化上独立的分枝，且与已报道的鲈形总目鱼类tnfα具有最近的亲缘关系：空间结构模拟显示：斜带石斑鱼tnfα与哺乳类tnfα的空间结构相似，内层与外层均由5个β折叠片结构构成。斜带石斑鱼tnfα基因长度为1801bp，由四个外显子和三个内含子组成，与其他鱼类具有相似的结构特征。 利用realtimepcr技术，分析了tnfα在健康斜带石斑鱼各组织中的表达情况以及分裂素lps、polyi：c对斜带石斑鱼头肾淋巴细胞tnfα基因表达的影响。定量结果显示，tnfα在健康斜带石斑鱼各组织中呈组成型表达，在头肾、脾、肾脏、鳃与下丘脑等组织中均有较高表达，在肠道与肌肉组织中的表达量最低；研究还发现tnfα在垂体与下丘脑中以较高水平表达，尤以下丘脑最高，提示tnfα在神经内分泌系统中起着重要作用。分裂素lps与polyi：c刺激斜带石斑鱼头肾淋巴细胞均能显著诱导tnfα基因的表达，但二者的作用效果并不相同。经lps刺激后的淋巴细胞tnfα基因表达量在16h达到了最大，而polyi：c刺激后的淋巴细胞tnfα基因表达量在检测的24h内一直在增大。 为了进一步研究斜带石斑鱼肿瘤坏死因子α的生物学功能，我们利用pet32a（+）质粒构建了表达tnfα成熟肽的重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌bl21中，通过对诱导条件的优化，发现在37℃、0．4mmiptg浓度诱导5h后获得较高产量的可溶性重组蛋白，经过镍柱纯化和脱盐处理后得到了高纯度的重组蛋白，并经westernblot证明其为目的蛋白。

关 键 词： 斜带石斑鱼 肿瘤坏死因子 同源克隆 克隆 融合表达 表达谱

分 类 号： [S965.334 Q785]

领　　域： [农业科学] [农业科学] [生物学]